摘要: 目的： 1.观察小鼠肝脏特异性Brahma相关基因1（Brahma-relatedgene1，Brg1）缺失对肝再生（LiverRegeneration，LR）的影响。 2.研究miR-187-5p在Brg1调控LR过程中的作用。 3.探讨Brg1及miR-187-5p与Hippo信号通路的联系，并初步阐明Brg1调... 展开 目的： 1.观察小鼠肝脏特异性Brahma相关基因1（Brahma-relatedgene1，Brg1）缺失对肝再生（LiverRegeneration，LR）的影响。 2.研究miR-187-5p在Brg1调控LR过程中的作用。 3.探讨Brg1及miR-187-5p与Hippo信号通路的联系，并初步阐明Brg1调控LR过程中的机制。 方法： 1.将Brg1loxP/loxP小鼠与albumin-Cre小鼠交配，选择性地敲除肝细胞中的Brg1。用蛋白质印迹法（WesternBlot，WB）检测肝脏特异性Brg1缺失（Brg1?/?)小鼠（KO组)肝组织样本中Brg1蛋白的表达，以验证Brg1基因敲除率；检测KO组小鼠肝体重比及肝功(ALT、AST)与正常C57BL/6小鼠（WT组）相比有无差别，并用HE染色及Ki-67免疫组化分别检测KO小鼠肝脏与WT小鼠相比有无病理学及肝细胞增殖情况改变。对8周龄雄性KO组小鼠及其同周龄、性别的WT组小鼠进行了2/3部分肝切除术（Partialhepatectomy，Ph）。在术后0h、24h、36h、48h、72h和168h（7d）采集小鼠肝脏组织样本并观察小鼠肝脏再生情况，并用免疫组化检测两组样本中反应肝细胞增殖指标（Ki-67及BrdU阳性细胞率）的情况。 2.利用TargetScan和miRWalk两个在线数据库对Brg1及Hippo信号通路中关键调控激酶LATS1的潜在靶miRNA进行相关性预测分析，并用定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）对样本中目标miRNA的表达进行验证。根据验证结果进行回复实验：对Brg1缺失小鼠（Brg1?/?)小鼠（KO组）注射相应外源性miRNA功能模拟物（agomir），并将其与同周龄、同性别的C57BL/6小鼠（WT组）上进行了2/3Ph。在术后0h、24h、36h、48h、72h和168h（7d）采集小鼠肝脏组织样本，观察小鼠肝脏再生情况，用免疫组化检测两组样本中反应肝细胞增殖指标（Ki-67和BrdU阳性细胞率）的情况。 3.用WB法检查KO组和WT组小鼠肝脏组织样本中周期蛋白（CyclinD1、CyclinA和CyclinE1）、周期蛋白激酶CDKs、Hippo信号通路中关键调控激酶LATS1及下游蛋白YAP表达情况，探讨Brg1及miR-187-5p与Hippo信号通路的联系，并初步阐明Brg1调控LR过程中的机制，以及miR-187-5p模似物回输后对上述细胞周期蛋白、周期蛋白激酶和LATS1及YAP的影响。 4.本实验所有数据采用SPSS22.0统计分析软件进行统计分析，结果用均数±标准差（M±SD）表示，以P＜0.05或Plt;0.01表示差异有统计学意义。 结果： 1.小鼠胚胎中肝细胞特异性Brg1缺失并未导致胚胎的死亡。KO组小鼠肝细胞中Brg1蛋白的表达值为（0.22±0.04），与WT组小鼠的（0.81±0.04）相比表达显著降低（Plt;0.01）。KO组小鼠与WT小鼠相比较，肝脏没有明显病理学改变。术前KO小鼠与WT小鼠相比，肝体重比（4.4%vs4.3%）、ALT(71.3U/Lvs76.0U/L)和AST(282.0U/Lvs290.0U/L)均无明显差异（Pgt;0.05）。Ph术后早期（36h、48h和72h），KO小鼠肝组织再生情况（肝体重比：2.48%、2.78%和2.77%）显著低于WT组（2.96%、3.26%和3.27%）（Plt;0.01）；36h-48h时，KO组小鼠肝细胞Ki-67阳性细胞比率（17.67%和16.34%）也显著低于WT组（69.23%和57.07%）（Plt;0.01）。两组BrdU阳性细胞率也与Ki-67结果相似。以上结果表明肝脏特异性Brg1敲除不会导致小鼠死亡，但会造成小鼠Ph后早期肝再生的延迟。 2.TargetScan和miRWalk在线数据库对miRNA的相关性进行了预测性分析，结果提示miR-187-5p对Hippo信号通路中关键激酶LATS1存在潜在调控作用，且与WT组miR-187-5p的表达（1.33）相比较，KO组中miR-187-5p的表达显著降低（0.34）（Plt;0.01）。通过荧光素酶报告实验，我们证明miR-187-5p可以直接结合LATS1。Ph术后早期（36h、48h和72h），与WT组肝体重比（2.87%、3.50%和3.43%）相比，注射相应外源性miR-187-5p功能模拟物agomir的KO组小鼠肝体重比（2.53%、3.18%和3.41%）无统计学差异（Pgt;0.05），表明补充外源性miR-187-5p后在Ph术后早期恢复了Brg1敲除造成的肝组织再生延迟现象。术后36h和48h时，KO小鼠肝细胞的增殖情况（Ki-67阳性细胞比率分别为71.33%和65.50%）与同时期WT组（73.33%和67.53%）相比无统计学差异（Pgt;0.05）。两组BrdU阳性细胞率也与Ki-67结果相似。以上结果表明Brg1可以正向调控miR-187-5p的表达，促进Ph后早期肝再生。 3.Ph后36h和48h，KO组小鼠肝细胞中的细胞周期蛋白激酶CDK1的表达量（0.20和0.13）显著低于WT小鼠（0.69和0.74）（Plt;0.05）。Ph后0h、24h、36h和48h时，细胞周期蛋白cyclinD1的表达量（0.01、0.23、0.20和0.26）低于WT小鼠（0.17、0.31、0.83和0.71）（Plt;0.05）。Ph后36h和48h，LATS1在KO组小鼠肝脏中表达量（0.83和0.70）显著高于WT组（0.60和0.36），而同时间点KO组去磷酸化的YAP表达量显著低于WT组（0.30和0.35vs0.43和0.64）（Plt;0.05）。输注外源性miR-187-5pagomir后，KO组小鼠与WT组小鼠在0h-72h中cyclinD1、CDK1、LATS1和去磷酸化的YAP的表达量的统计学差异几乎被消除（Pgt;0.05）。以上结果表明miR-187-5p模似物回输后能恢复因Brg1基因缺失所致的上述细胞周期蛋白、周期蛋白激酶和Hippo信号通路关键调控激酶、蛋白的表达。因此，Brg1可能通过miR-187-5p抑制Hippo信号通路并促进小鼠肝再生。 结论： 1.肝脏特异性Brg1敲除不会导致小鼠胚胎死亡或引起其他病理学改变，但会造成小鼠Ph后早期肝再生的延迟。 2.Brg1可以正向调控miR-187-5p的表达，补充外源性miR-187-5p能恢复小鼠由于肝脏特异性Brg1敲除造成的Ph后早期肝再生的延迟。 3.Brg1可能通过miR-187-5p抑制Hippo信号通路正向调控小鼠肝再生。 收起