摘要: 磺基转移酶(sulfotransferase，SULT)是磺基转移酶超家族成员，通过催化磺酸基供体化合物3’.磷酸腺苷.5’一磷酰硫酸(PAPS)上的磺酸基团(SO3-)转移至特定底物上的羟基或氨基上以形成水溶性更强的硫酸酯类化合物从而更好地排出体外。根据亚细胞定位将磺... 展开 磺基转移酶(sulfotransferase，SULT)是磺基转移酶超家族成员，通过催化磺酸基供体化合物3’.磷酸腺苷.5’一磷酰硫酸(PAPS)上的磺酸基团(SO3-)转移至特定底物上的羟基或氨基上以形成水溶性更强的硫酸酯类化合物从而更好地排出体外。根据亚细胞定位将磺基转移酶分为胞质磺基转移酶(cytosolicSULTs)以及膜偶联磺基转移酶(membrane-associated，SULTs)。磺基转移酶在动植物以及微生物中高度保守并且具有广泛的底物多样性，在维持生物体稳态和调节生物体代谢等方面发挥着重要作用。本文以重要仓储害虫赤拟谷盗(Tribolium castaneum)作为研究材料，在克隆6个赤拟谷盗胞质磺基转移酶基因的基础上，对其组织表达模式、解毒代谢功能、表达调控机制及其上游FOXO和CncC-Keap1通路调控关系进行分析。 从赤拟谷盗转录组中检索得到了6个胞质磺基转移酶基因TcSULT1-6，通过RT-PCR获得了这6个胞质磺基转移酶基因的开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)序列。赤拟谷盗胞质磺基转移酶基因ORF长度在957bp(TcSULT1)～1095bp(TcSULT6)之间，编码318～364个氨基酸。分子质量在37.40kDa(TcSULT3)～43.28kDa(TcSULT6)之间，等电点在5.89(TcSULT4)～8.18(TcSULT3)之间。氨基酸序列比对发现TcSULTs具有保守的SULT特征性基序(N-YPK(A/S)GTxW，C。RKGxxGDW(V/K)NxFT)，系统发生分析也显示TcSULTs与其他昆虫SULTs同源。 利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析TcSULTs在赤拟谷盗7日龄成虫不同组织中的表达情况，发现TcSULT2的mRNA表达水平在马氏管中最高，在脂肪体中最低;TcSULT3的mRNA表达水平在马氏管中最高，在卵巢中最低;TcSULT5的mRNA表达水平在卵巢中最高，在头部最低;TcSULT6的mRNA表达水平在头部最高，在卵巢中最低;而TcSULT1和TcSULT4在各组织中表达水平都很低。 利用RT-qPCR检测了LC50(5.87mg/L)溴氰菊酯对TcSULTs的诱导作用，结果显示与对照组相比，TcSULT2表达水平在溴氰菊酯处理2h时显著上调了3.69倍;TcSULT3表达水平在2h时上调倍数最高，达到了9.95倍，其余各时间段也均显著上调;TcSULT5表达水平在2h及4h时分别显著上调了2.58倍和2.35倍;TcSULT6表达水平在1h时先是下调了56％，后在4h时又显著上调了1.81倍。进一步利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术研究发现，赤拟谷盗4日龄雌蛹中注射了dsTcSULTs6天后，TcSULT2、3、5和6的mRNA表达水平分别显著下调了84.3％，95％，81.7％并1187.7％，并且TcSULTs敲减后的赤拟谷盗显示出对溴氰菊酯更高的敏感性。这些结果表明TcSULTs可以响应溴氰菊酯的诱导，并且可能在赤拟谷盗对溴氰菊酯解毒代谢过程中发挥重要作用。 利用RNAi技术、RT-qPCR和双荧光素酶报告基因分析探究TcCncC对TcSULTs的表达调控。首先在15日龄幼虫中敲减了TcCncC，在注射后第6天时TcCncC的mRNA表达水平显著下调了5l％。TcCncC敲减使得死S觇乃和6的mRNA表达水平分别显著下调了36.7％和60.7％，而TcSULT5mRNA表达水平上调至对照组的69.8倍。双荧光素酶报告基因分析显示TcCncC以及TcMaf在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9细胞中共表达时使得TcSULT3和TcSULT6的启动子活性分别上调至对照组的2.71倍和2.15倍，使得TcSULT5的启动子活性显著下调了70.57％。这些结果表明TcCncC可以结合TcSULT3、5和6的启动子区域直接调控它们的表达。 利用RNAi和RT-qPCR研究TcFOXO在外源化合物代谢中的作用。TcFOXO敲减使得TcSULT3和TcSULT6的mRNA表达水平分别显著降低了50.3％和33％，并且引起赤拟谷盗对溴氰菊酯敏感性的上升。这一结果表明死阳加可能通过调节TcSULT3和TcSULT6的表达来参与溴氰菊酯解毒代谢。 利用RT-qPCR、RNAi、双荧光素酶报告基因分析和凝胶阻滞实验(Electrophoretic mobility shift assay，EMSA)探讨FOXO以及CncC-Keap1信号通路间的调控关系。TcFOXO敲减显著降低了TcCncC和TcKeap1的mRNA和蛋白质水平。双荧光素酶报告基因分析显示在Sf9细胞中过表达TcFOXO使得TcCncC的启动子活性上调至对照组的3.7倍，而对于TcKeap1的启动子活性没有显著影响。EMSA分析也显示在体外TcFOXO蛋白可以与TcCncC启动子区域结合。这些研究结果表明TcFOXO可以直接调控TcCncC的表达，但是不能直接调控TcKeap1的表达。 利用RT-qPCR、RNAi、双荧光素酶报告基因分析和EMSA探讨转录因子CncC对其抑制蛋白Keap1的反馈调控作用。首先敲减了15日龄幼虫中的TcCncC并发现敲减TcCncC后显著降低了TcKeap1的mRNA以及蛋白质水平。双荧光素酶报告基因分析显示TcCncC单独过表达使得TcKeap1的启动子活性上升至对照组的2.2倍，TcCncC与TcMaf共表达时使TcKeap1的启动子活性上升至对照组的2.98倍。EMSA分析也显示在体外TcCncC蛋白可以与TcKeap1启动子区域结合。这些研究结果表明TcCncC可以直接调控TcKeap1的表达。 本文系统分析了赤拟谷盗TcSULTs功能及上游FOXO和CncC-Keap1调控关系，研究结果对揭示昆虫解毒代谢的调控机制具有重要的科学意义。 收起