摘要: 粘虫Mythimna separata(Walker)隶属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuide)，是一种重要的世界性农业害虫。粘虫之所以在各地频繁爆发以致成灾，与其强大的生殖力和特殊的生殖适应性密不可分。围绕生殖调控决定生殖潜能与适应性这一问题，开展生殖相... 展开 粘虫Mythimna separata(Walker)隶属于鳞翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuide)，是一种重要的世界性农业害虫。粘虫之所以在各地频繁爆发以致成灾，与其强大的生殖力和特殊的生殖适应性密不可分。围绕生殖调控决定生殖潜能与适应性这一问题，开展生殖相关基因的研究是必要的。卵黄原蛋白受体(Vitellogenin receptor,VgR)作为介导脂肪体与卵巢间卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg)转运的关键蛋白，对于卵黄的发生以及卵母细胞的发育和成熟具有重要作用。因此，开展此基因的相关研究具有重要的理论意义。本文对粘虫卵黄蛋白受体VgR基因cDNA全长序列进行了克隆、表达模式的建立以及功能的鉴定，旨在为粘虫生殖机制提供理论基础。 本文利用反转录PCR(everse transcription-PCR,RT-PCR)和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了粘虫的VgR基因的全长cDNA序列，并对其进行了生物学信息分析。然后以β-Tubulin作为内参基因，运用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)技术建立了该基因在粘虫不同发育阶段以及不同组织的表达模式，并通过RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术对VgR基因进行沉默，探究其差异性以进一步确定该基因功能。 1.粘虫VgR基因cDNA全长为5380bp，开放阅读框ORF为5328bp，起始密码子ATG位于16-18位核苷酸，终止密码子位于5341-5343位核苷酸，总共编码1775个氨基酸，分子量大小为198.995kDa，等电点为5.11。粘虫VgR包含154个磷酸化位点，16个糖基化位。保守结构域分析结果表明，粘虫VgR蛋白为低密度脂蛋白受体，缺少O-糖链结构域(O-linked carbohydratesdomain,OLSD)。粘虫VgR蛋白包含两个配体结合域(Ligand-binding domain,LBD)和两个表皮生长因子前体同源域(EGF-precursor homology domain,EGFP)。两个配体结合域分别包括4个和7个A型重复序列(LDLa)；其中一个EGFD包括4个B型重复基序和7个YXTD基序集群，而另一个EGFD由3个B型重复基序(LDLb)和2个YXTD构成。该蛋白存在跨膜区(Transmembrane domain,TMD)，属于跨膜蛋白。VgR的信号肽位于N端起始位置，由MKYECLILVVLVTWCA EFA这20个氨基酸构成。系统发育树中，粘虫VgR与鳞翅目昆虫聚在一支，与同为夜蛾科的棉铃虫Helicoverpa armigera和斜纹夜蛾Spodoptera litura亲缘最近。 2.本实验建立了VgR基因在粘虫雌蛾和幼虫不同组织中的表达模式。在雌蛾各组织中VgR均有表达，卵巢内表达水平显著高于其它组织，表皮中表达水平最低。在粘虫幼虫不同组织中的表达模式中，脂肪体内VgR基因相较于头部、表皮、肠道有显著表达，但表达量很低。 3本实验建立了VgR基因在雌性粘虫不同发育阶段的表达模式，结果表明粘虫VgR基因主要在成虫期表达，表达量随羽化时间总体呈现先上升后下降趋势，于羽化第二天有明显表达上升，升至第五天达到顶峰，从第六天开始下降。 4.本实验利用RNAi技术对VgR基因进行干扰，结果显示处理组(VgR-dsRNA)VgR基因的表达量于注射后48-60h明显低于阴性对照组(GFP-dsRNA)，说明干扰有效地抑制了卵黄原蛋白受体的表达。同时，分别将此两组的雌蛹培养至羽化第三天，然后将其卵巢进行解剖，对比发现，处理组的粘虫卵巢中卵子的卵黄蛋白的沉积明显受到抑制，发育较阴性对照迟缓，与该基因表达量检测结果一致。 收起