摘要: 生殖和解毒代谢都需要持续的能量供给，昆虫在对杀虫剂产生抗药性的同时通常伴随着生殖相关适合度代价，但其内在机制尚不明确。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin，... 展开 生殖和解毒代谢都需要持续的能量供给，昆虫在对杀虫剂产生抗药性的同时通常伴随着生殖相关适合度代价，但其内在机制尚不明确。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)通路与哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target ofrapamycin，mTOR)/核糖体蛋白S6激酶(Ribosomal protein S6 kinase，S6K)通路分别通过感受细胞ATP和营养水平从而调控能量稳态，但目前关于AMPK和S6K调控昆虫解毒代谢和生殖的机制还知之甚少。本文以赤拟谷盗为研究对象，对TcAMPKα和TcS6K1在赤拟谷盗不同发育阶段和组织部位的表达特性、对于逆境胁迫的响应以及在赤拟谷盗解毒代谢和生殖中的作用及其调控机制进行研究。 1.赤拟谷盗AMPKa基因对逆境胁迫的响应及功能分析 利用RT-qPCR和Western Blot(WB)检测百草枯、高温(45℃)和低温(4℃)处理对TcAMPKα的mRNA、总蛋白和磷酸化水平的影响。发现，百草枯处理2 h后，TcAMPKα基因mRNA表达水平达到峰值，比对照上调25.15倍;处理2、4、12 h后，TcAMPKα总蛋白水平分别显著上调3.33、2.35和2.95倍;处理12 h后，TcAMPKαThr172磷酸化水平显著上调3.08倍。45℃处理4 h后，TcAMPKα mRNA和磷酸化表达水平达到峰值，磷酸化水平显著上调9.95倍。4℃处理后，TcAMPKα基因mRNA表达水平在12 h后达到峰值;处理2 h后，TcAMPKα磷酸化水平达到峰值，显著上调1.76倍。此外，高低温胁迫下的TcAMPKα总蛋白水平在处理1.12 h都有不同程度上调。 利用RNA干扰(RNA interference，RNAi)分析TcAMPKα基因在赤拟谷盗耐受胁迫过程中的作用。百草枯处理雌成虫24 h后，dsTcAMPKn处理组死亡率为69.04％，显著高于WT组(42.86％)和IB组(38.10％)。此外，注射了dsTcAMPKα的赤拟谷盗雌成虫在45℃和4℃环境中的平均生存时间分别为26.00 h和155.33 h，显著低于WT组(55.00 h;242.67 h)和IB组(54.83 h;222.00 h)。 2.RNA干扰介导的TcAMPKα基因敲减对赤拟谷盗糖脂代谢的影响 利用RNAi研究TcAMPKα在赤拟谷盗脂质和碳水化合物代谢中的作用。与dsEGFP处理组相比，dsTCAMPKQ处理组甘油三酯含量显著上调53.49％。dsTcAMPKα处理组葡萄糖水平也较dsEGFP处理组显著上升62.34％。但与对照组相比，dsTcAMPKα处理组海藻糖水平显著下调8.56％。同时利用AMPK激活剂AICAR(5-Aminoimidazole-4-carboxamide1-β-D-ribofuranoside)激活AMPK后发现，与对照组相比，AICAR处理组赤拟谷盗幼虫甘油三酯以及葡萄糖水平分别显著下调34.60％和41.89％，但海藻糖水平比对照组显著上升17.07％。 利用转录组测序和RT-qPCR分析赤拟谷盗TcAMPKα基因敲减后的转录组响应。dsTcAMPKα和dsEGFP处理组之间存在1184个差异表达基因，包括与脂质和碳水化合物代谢相关基因，其中催化甘油三酯水解的昆虫脂肪细胞甘油三酯脂酶(Adiposetriacylglycerol lipase)同源基因brummer显著下调;脂肪酸合成通路中的两个脂肪酸合成酶基因(Fatty acid synthetase，FAS1-2)以及调控糖脂代谢的关键转录因子碳水化合物响应元件结合蛋白(Carbohydrate response element-binding protein，ChREBP)都显著上调。RT-qPCR验证实验结果与转录组测序结果高度一致。 3.多效性AMPK/CncC信号通路对赤拟谷盗解毒代谢与生殖权衡的调控机制 利用RT-qPCR和WB检测溴氰菊酯处理对TcAMPKα的mRNA、总蛋白和磷酸化水平的影响。溴氰菊酯处理赤拟谷盗4日龄雌成虫后，诱导了TcAMPKα mRNA和磷酸化水平的上调表达，且都在处理后4 h达到峰值;同时也诱导了TcAMPKα总蛋白水平的上调表达，在处理后2 h达到峰值。此外通过酶联免疫吸附(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)对MDA、ATP、ADP和AMP的测定发现，溴氰菊酯处理12 h后，MDA水平显著上调2.47倍，同时溴氰菊酯处理1-12 h后，AMP∶ATP和ADP∶ATP比率也显著上调。 利用生物测定和RT-qPCR检测dsTcAMPKα和/或AICAR处理对溴氰菊酯耐受性影响以及对溴氰菊酯抗性相关转录因子Cap''n'' collar isoform C(CncC)靶标基因CYP6BQs的mRNA表达水平的影响。注射了dsTcAMPKα的试虫在溴氰菊酯处理后的生存率仅为23.33％，显著低于对照组生存率(50％)。dsTcAMPKα的注射减弱了溴氰菊酯对于CYP6BQs的诱导效果。相反，与对照相比，AICAR处理可以显著诱导CYP6BQs基因的上调表达。进一步研究发现，AICAR处理赤拟谷盗4日龄雌成虫后，其产卵量显著降低了94.06％，同时显著提高了赤拟谷盗体内20E的含量，降低了JH的含量。RT-qPCR结果表明，与对照组相比，AICAR处理能够上调与20E合成相关基因Phantom和Shade、20E受体基因EcR和USP以及JH水解相关基因JHEHr3和JHEHr4的表达，并且AICAR处理能够下调JH早期的响应基因Kr-h1和Met的表达，但JHAMT不受AICAR影响。 利用免疫荧光、酵母双杂交、免疫共沉淀、GST pull-down和双分子荧光互补技术(BiFC)检测发现，TcAMPKα与TcCncC在体外和体内均会产生相互作用。通过亚细胞定位实验研究发现溴氰菊酯处理雌成虫4 h后能够促进TcCncC的核易位，溴氰菊酯处理敲减了TcAMPKα的雌成虫4 h后，TcCncC核易位效应被减弱。进一步通过磷酸化水平检测试剂盒检测发现，在体外表达TcAMPK-αβγ T172D能够提高TcCncC的磷酸化水平。WB检测发现AICAR、溴氰菊酯处理能够提高体内CncC泛丝氨酸/苏氨酸磷酸化水平，dsTcAMPKα处理能够削弱溴氰菊酯诱导的CncC泛磷酸化水平。 利用RT-qPCR、RNAi、双荧光素酶报告基因以及凝胶阻滞实验(EMSA)分析TcCncC对于JH与20E信号通路相关基因的转录调控，发现敲减TcCncC显著下调20E合成相关基因(Phantom和Shade)、20E受体基因(EcR和USP)以及JH水解相关基因(IJEHr2，JHEHr3，JHEHr4)的表达。相反，敲减TcCncC显著上调与JH响应相关的基因Kr-h1和Met的表达。共表达TcCncC及其伴侣蛋白TcMaf能够增强TcPhantom、TeShade和TcJHEHr3启动子驱使的荧光素酶的表达，并且EMSA检测结果表明TcCncC能够与TcPhanwm、TcShade和TcJHEHr3启动子区域保守调控位点相结合。 4.S6K1基因对赤拟谷盗生殖的调控 利用RNAi和RT-qPCR检测TcS6K1在赤拟谷盗生殖中的作用及其对保幼激素合成相关基因、生殖相关基因和相关转录因子TcFOXO mRNA表达水平的影响。在FemaleTcS6k1 RNAi×MaleWT和FemaleWT×MaleTcSK1 RNAi处理组中的产卵量显著低于对照组Female1B×MaleWT和FemaleWT×Male1B。敲减TcS6K1后，雌雄成虫JH合成相关基因法尼醇脱氢酶(Farnesol dehydrogenase，TcFDH)mRNA表达水平显著下调;雌成虫TcVg1和TcVg2的mRNA表达水平显著下调;雄成虫两个附腺分泌蛋白基因的mRNA表达水平显著下调。 利用RNAi、WB和EMSA检测dsTcS6K1处理对TcFOXO亚细胞定位的影响以及对保幼激素合成相关基因的转录调控。与对照组相比，注射dsTcS6K1后，TcFOXO核易位增加，然而总体蛋白水平没有变化。敲减TcFOXO导致TcFDH表达水平显著提高7.74倍，然而对TcJHAMT和TcS6K1 mRNA表达水平没有影响。EMSA检测表明TcFOXO能够与TcFDH的启动子区域保守调控位点结合。 本文研究结果表明，TcAMPKα在保护赤拟谷盗免受不良环境以及氧化应激损伤的过程中发挥了重要作用，并能转录调控赤拟谷盗糖脂代谢相关基因;赤拟谷盗通过多效性的AMPK-CncC信号通路转录调控解毒代谢与生殖相关基因来介导解毒代谢与生殖之间的权衡。TcS6K1能够通过TcFOXO-JH信号通路调控赤拟谷盗的生殖，同时TcS6K1能够通过调控ATP合成与水解相关蛋白的表达来调控TcAMPKα活性，并通过转录调控解毒代谢以及抗氧化相关基因来介导赤拟谷盗对于溴氰菊酯的敏感性。研究结果对于进一步揭示昆虫AMPK和S6K1的功能以及昆虫对解毒代谢和生殖的权衡机制具有重要的科学意义。 收起