摘要: 目的： 传统观念认为:牵张力产生成骨效应，压应力产生破骨效应，但是有研究报道压应力也可以促使骨的生成，前期课题组已有结果显示在施加2g/cm2压应力时成骨效应及破骨效应均达到最佳，这提示压应力的大小可能是影响成骨细胞功能的关键因素，即在... 展开 目的： 传统观念认为:牵张力产生成骨效应，压应力产生破骨效应，但是有研究报道压应力也可以促使骨的生成，前期课题组已有结果显示在施加2g/cm2压应力时成骨效应及破骨效应均达到最佳，这提示压应力的大小可能是影响成骨细胞功能的关键因素，即在轻压应力作用下，成骨细胞的成骨功能达到最佳，成骨细胞的功能受多种转录因子的调控，其中miRNA就是一种重要的基因转录后调节因子，因此本研究采用2g/cm2组为实验组，通过构建MC3T3-E1细胞体外压应力加载模型，探索压应力对成骨细胞内microRNA的表达谱改变，并进一步探究miR-222-3p的可能靶基因以及其对成骨分化的调控作用及机制。 方法： 1.构建MC3T3-E1细胞体外3D-压应力加载模型，通过Calcein-AM/PI染色以及CCK8实验检测此3D培养加力装置的可行性。 2.设置0g/cm2组为对照组，2g/cm2组为实验组，加力24h后，通过qRT-PCR以及ALP染色探究压应力对成骨细胞成骨分化的影响;通过高通量测序技术检测两组之间差异表达的miRNAs，并结合qRT-PCR进行验证。 3.qRT-PCR验证后，确定目标miRNA，通过生物信息学软件预测可能靶基因，通过瞬时转染技术进行细胞内目标miRNA的过表达及干扰、利用qRT-PCR、Western blot以及双荧光素酶报告基因实验进行靶基因的验证以及miR-222-3p的功能验证，以确定miR-222-3p对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响以及机制。 结果： 1.通过Calcein-AM/PI染色结果显示细胞在鼠尾胶原基质的3D培养模型里，生长状况良好;CCK8实验结果显示此加力模型不会影响成骨细胞的活性。 2.2g/cm2组与0g/cm2组相比:qRT-PCR以及ALP染色结果显示压应力促进了MC3T3-E1细胞的成骨分化;miRNAs表达谱结果显示:加力后74个miRNAs有表达差异，43个表达上调，31个表达下调，qRT-PCR验证结果显示miR-222-3p表达下调且改变最为明显，通过生信软件预测其靶基因可能为Runx2和BTG2。 3.Western blot结果显示在加力后Runx2表达含量升高，与miR-222-3p改变趋势相反，而BTG2表达改变与miR-222-3p改变趋势相同，因此排除BTG2为靶基因的可能。进而在MC3T3-E1细胞中过表达和干扰miR-222-3p，qRT-PCR、Western blot实验结果显示Runx2表达水平改变与miR-222-3p的改变成负性关系，双荧光素酶实验也进一步确定了miR-222-3p与Runx2可以有效地结合。功能验证结果显示过表达miR-222-3p时，成骨相关基因的表达水平显著下降。 结论： 1.在本研究中，压应力促进了MC3T3-E1细胞成骨分化，且使成骨细胞内多种miRNAs发生表达改变，其中miR-222-3p下调变化最为明显。 2.miR-222-3p可能通过靶向Runx2抑制成骨细胞的成骨分化。 收起