摘要: 檀香(SantalumalbumL.)是檀香科(Santalaceae)檀香属(Santalum)常绿半寄生小乔木，广泛分布于印度、印度尼西亚和澳大利亚，其商业价值主要在于芳香气味的心材以及从心材中提取的檀香油，而檀香醇是檀香油的主要成分。目前檀香醇生物合成的调控机制还... 展开 檀香(SantalumalbumL.)是檀香科(Santalaceae)檀香属(Santalum)常绿半寄生小乔木，广泛分布于印度、印度尼西亚和澳大利亚，其商业价值主要在于芳香气味的心材以及从心材中提取的檀香油，而檀香醇是檀香油的主要成分。目前檀香醇生物合成的调控机制还未研究清楚。为了促进檀香醇的生物合成及积累并研究其分子机制，本研究以檀香幼苗为材料，通过茉莉酸甲酯(MeJA)处理，观察MeJA对檀香醇合成途径关键酶基因表达的影响。同时鉴定檀香醇生物合成上游甲羟戊酸(MVA)途径相关酶基因并研究其表达模式和功能，并进一步克隆获得檀香羟基甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因的启动子序列以及通过缺失分析鉴定HMGR1启动子不同区域的功能，主要研究结果如下: 1、对MeJA处理后的檀香幼苗茎段进行转录组测序，共筛选出3，063条差异基因，包括1，613条上调基因和1，450条下调基因。进一步分析差异基因发现萜类代谢合成途径和激素信号转导途径相关的关键酶基因表达量显著上调，同时筛选出5条MVA代谢途径上游关键酶基因，即SaAACT、SaHMGS、SaMK、SaHMGR1以及SaHMGR2。 2、通过酵母功能互补验证方法验证了乙酰辅酶A酰基转移酶(SaAACT)、羟基甲基戊二酰辅酶A合成酶(SaHMGS)和甲羟戊酸激酶(SaMK)基因编码的蛋白均具有相应的酶活性。共聚焦显微镜下观察SaAACT蛋白定位于细胞核中，而SaHMGS和SaMK蛋白则定位于细胞质中。 3、克隆檀香萜类化合物MVA代谢途径上游限速酶基因SaHMGR1和SaHMGR2的全长ORF并对其进行生物信息学及系统发育分析，结果表明:SaHMGR1与SaHMGR2蛋白具有HMGR超级家族中HMGRⅠ类酶的典型结构域，均包含了4个催化位点、6个NADPH结合位点、5个底物结合区域、4个抑制剂结合位点和若干个二聚体界面区域。系统发育分析结果表明SaHMG1和SaHMGR2和其他来源的相应的基因有较高的保守性。利用实时荧光定量PCR的方法检测檀香SaHMGR1和SaHMGR2基因在檀香根、边材、心材、幼叶、成熟叶和小枝中均有表达。且二者均在根中表达量最高。SaHMGR1成熟叶中的表达量比心材中高，而SaHMGR2在成熟叶中的表达量比心材中低;两者最低的表达量均在幼叶中。100μMMeJA处理后，SaHMGR1和SaHMGR2基因在幼苗茎中的表达量均先升高后降低，在处理24h后达到最高值，之后逐渐降低。SaHMGR1基因在MeJA处理7d后仍比未处理时的表达量高，而SaHMGR2在经过MeJA处理处理7d后降至未处理时的表达量。通过构建含有His标签的重组载体诱导檀香HMGR基因在大肠杆菌BL21(DE3)中表达，并成功通过镍柱Ni-NTA纯化到檀香SaHMGR1和SaHMGR2蛋白。利用酶学反应实验验证本实验研究的两个檀香HMGR蛋白均可以催化HMG-CoA生成MVA且SaHMGR2蛋白的活性低于SaHMGR1蛋白。在共聚焦显微镜下观察SaHMGR1和SaHMGR2蛋白均定位于内质网中。 4、通过FPNI-PCR克隆檀香HMGR1基因的启动子片段，分析可知该启动子除了含有起始转录位点A、TATA-box、CAAT-box等基本顺式作用元件外，还含有4个茉莉酸相关元件、7个脱落酸相关元件、2个水杨酸相关元件等激素响应元件，2个厌氧诱导相关元件，1个玉米蛋白代谢调控元件以及若干光应答元件。通过GUS组织染色发现该启动子不同5''端缺失片段具有启动檀香HMGR1基因在烟草叶片中表达的活性，之后将构建好的重组载体通过叶盘法转入烟草，并获得了阳性植株。 本实验通过以上研究结果以期在转录水平了解檀香HMGR基因的分子调控机制，进一步为研究檀香醇代谢途径的调控提供理论支撑。 收起