摘要: 檀香为檀香科檀香属(Santalum)植物的总称，是分布于太平洋热带地区的半寄生常绿小乔木。檀香是世界上最珍贵林木之一，其经济价值最高的部分是心材，具有芳香气味并可提取精油。檀香精油的主要成分是伐-檀香醇、β-檀香醇、epi-β-檀香醇、α-exo-香柠檬... 展开 檀香为檀香科檀香属(Santalum)植物的总称，是分布于太平洋热带地区的半寄生常绿小乔木。檀香是世界上最珍贵林木之一，其经济价值最高的部分是心材，具有芳香气味并可提取精油。檀香精油的主要成分是伐-檀香醇、β-檀香醇、epi-β-檀香醇、α-exo-香柠檬醇和甜没药醇等倍半萜类化合物。目前，檀香倍半萜合成的调控机制并不清楚，本研究主要围绕这个科学问题而展开，并取得以下研究成果: 1.为了筛选檀香实时荧光定量PCR(RT-qPCR)研究中稳定表达的内参基因，首先对已经公布的檀香不同组织的转录组数据库进行了分析，初步筛选了包括檀香Actin基因在内的13个候选内参基因。以七年生檀香的根、茎、叶片和愈伤组织以及分别以水杨酸(SA)、赤霉酸(GA3)和茉莉酸甲酯(MeJA)处理后的愈伤组织为材料，利用geNorm、NormFinder、BestKeeper和RefFinder计算方法系统筛选和鉴定了檀香不同器官和愈伤组织在不同激素处理下能够稳定表达的内参基因。结果表明:ODD和Fbp在水杨酸处理中、CSA和Fbp3在MeJA处理中、PP2C和Fbp2在GA处理中以及Fbp1和Fbp2在这三种激素处理中分别为最稳定表达的内参基因;FAB1A和PP2C是四种不同组织器官中最稳定表达的内参基因。 2.利用Tail-PCR的方法克隆了檀香油主要倍半萜甜没药烯合成基因SaBS起始密码子ATG上游1390 bp的启动子序列。同时分别在不同顺式作用元件位点进行了截断，分别构建GUS载体并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana)，经过筛选获得了相应的转拟南芥纯合体株系。GUS组织化学染色和荧光活性检测表明，SaBS启动子在拟南芥的根、茎秆、叶片、花絮和角果中均有较高的表达活性，并且其表达活性明显受到SA的诱导;在SaBS启动子-978 bp到-404 bp之间的区段GUS活性很低，推测有抑制因子结合元件的存在;起始密码子ATG上游171 bp的片段具有和克隆的全长启动子相同的活性。 3.利用Tail-PCR的方法成功克隆了檀香油主要成分倍半萜α-檀香烯、β-檀香烯、epi-β-檀香烯和α-exo-香柠檬烯合成基因SaSSy起始密码子ATG上游1437bp的启动子序列。同时在不同顺式作用元件位点进行了截断，分别构建GUS载体并瞬时表达烟草，GUS活性检测发现不同长度的启动子序列均具有较强的GUS活性，并且其表达活性显著受到MeJA的诱导;起始密码子ATG上游264 bp的片段具有和克隆的全长启动子相同的活性。 4.对MeJA处理后的檀香愈伤组织进行了转录组测序。共筛选到410个差异表达的基因，其中上调表达基因有294个，下调表达基因有136个。KEGG富集分析发现这些差异基因主要参与了植物激素信号转导、半胱氨酸和蛋氨酸代谢等过程。进一步分析发现MeJA途径相关基因的表达量均出现显著变化，并且檀香主要倍半萜合成基因SaSSy和SaCYP736A167等的表达量显著上调。通过分析，我们筛选了在MeJA途径中可能参与檀香倍半萜合成的调控基因，利用RACE技术成功进行了克隆并命名为SaMYC2a。此基因具有典型的bHLH结构域，与茶树（Camellia sinensis）CsMYC2、长春花（Catharanthus roseus）CrMYC2以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtMYC2有较近的系统进化关系。亚细胞定位表明SaMYC2a定位于细胞核中。SaMYC2a在檀香的根、心材、叶片和愈伤组织中均有较高水平的表达，并且其表达量受到MeJA的快速诱导。通过构建SaMYC2a超表达载体，分别遗传转化拟南芥AtMYC2的突变体jin1-8和野生型拟南芥植株表明，在jin1-8中过表达SaMYC2a后出现对MeJA较为敏感的表型，说明SaMYC2a能互补AtMYC2的突变体的部分功能;在jin1-8和野生型拟南芥中，SaMYC2a过表达能够提高转化拟南芥植株倍半萜合成酶基因TPS11的表达量，但对TPS21的表达没有显著影响。双荧光素酶报告基因检测表明，SaMYC2a可以结合到SaSSy基因的启动子上，正向调控SaSSy的表达。通过构建SaMYC2a超表达载体，利用基因枪法将该基因轰击到檀香愈伤组织中，通过荧光检测和RT-qPCR分析表明，SaMYC2a在檀香体内可以正调控SaSSy基因的表达。以上结果证明SaMYC2a是SaSSy基因的直接调控基因，其在JA介导的檀香倍半萜合成过程中发挥着重要作用。 收起