摘要: 羊肉因其高蛋白、低脂肪和低胆固醇而广受消费者的喜爱，但我国的肉羊生产目前仍存在屠宰率低、日增重低等问题，整体产肉性能不高。因此，改善肉羊产肉性能具有广阔的发展前景。动物肌肉生长性状受遗传因素及环境因素共同调控，不仅对个体的生长发育... 展开 羊肉因其高蛋白、低脂肪和低胆固醇而广受消费者的喜爱，但我国的肉羊生产目前仍存在屠宰率低、日增重低等问题，整体产肉性能不高。因此，改善肉羊产肉性能具有广阔的发展前景。动物肌肉生长性状受遗传因素及环境因素共同调控，不仅对个体的生长发育起着重要作用，而且与肉畜的产肉性能紧密相关。目前，虽已从基因和蛋白水平研究了肌肉发育的调控机制，但关于非编码序列调控肌肉发育的研究仍十分有限。虽然研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在调控肌肉生长发育过程中发挥了重要作用;然而，有关肉羊特别是湖羊肌肉相关lncRNA的特征和表达模式尚不清楚。因此，本研究以湖羊为对象，分析了三个发育阶段背最长肌及成肌细胞分化前后的lncRNA特征和表达模式，筛选与肌肉发育相关的候选lncRNA，并验证其在肌肉发育过程中的调控方式，这不仅对深入研究湖羊肌肉发育调控机制具有重要意义，而且为肉羊生长调控提供有力支撑。主要研究结果如下: 1.不同发育阶段湖羊背最长肌差异表达lncRNA的研究 为了挖掘调控湖羊肌肉生长发育的功能性lncRNA，通过链特异性Ribo-ZeroRNA测序技术检测了湖羊三个发育阶段的背最长肌lncRNA，获得6924个lncRNA，分别通过比较(对照与试验)胎羊与羔羊，羔羊与成年羊，胎羊与成年羊，筛选出差异表达的lncRNA和基因。基于GO和KEGG数据库的功能注释分析，差异表达的lncRNA的靶基因显著富集于器官形态发生，骨骼系统发育，对刺激的反应以及与肌肉有关的功能条目。此外，构建了差异表达的靶基因和lncRNA的共表达网络，其中包括肌肉生长调节因子，例如RTL1和JPH2。最后，验证了6个lncRNA及其靶基因的表达，结果表明随着肌肉发育，候选lncRNA及其靶基因均呈现一致的表达趋势。本研究扩展了绵羊肌肉lncRNA数据库，为深入研究绵羊肌肉生长发育分子调控机制提供了新的候选调节因子，为提高绵羊产肉性能提供理论参考。 2.湖羊成肌细胞分化前后差异表达lncRNA的研究 为了探索参与湖羊成肌细胞增殖与分化的功能性lncRNA，对分离纯化的成肌细胞和分化的肌管进行lncRNA测序，检测lncRNA及其靶基因在细胞诱导分化过程中的表达情况。首先，采用Ⅰ型胶原酶和胰酶消化法分离纯化湖羊成肌细胞，采用免疫荧光和qRT-PCR法检测成肌细胞中标志基因的表达;其次，采用Ribo-ZerolncRNA测序技术检测lncRNA及其靶基因的表达，筛选参与湖羊成肌细胞增殖与分化的lncRNA。结果显示，分离纯化的湖羊成肌细胞生长状态良好，细胞标志基因Desmin、MYODl、MYOG和PAX7均表达。测序后共获得13，896个lncRNA，与肌细胞相比，分化的肌管中共鉴定得到280个差异表达lncRNA，包括225个表达上调的lncRNA和55个表达下调的lncRNA;2322个差异表达mRNA，包括1443个表达上调的mRNA和879个表达下调的mRNA。GO功能注释分析显示，差异表达lncRNA的靶基因富集在肌肉收缩、线粒体、催化活性等GOterm中;差异基因显著富集在与肌肉生长发育相关的GOterm中，包括微管锚定、肌肉收缩、细胞周期调节、骨骼肌收缩、肌肉器官发育和横纹肌组织发育等。差异表达lncRNA的靶基因富集在细胞因子-细胞因子受体相互作用、脂肪细胞因子信号通路、RIG-Ⅰ-Like受体信号通路和Jak-STAT等KEGG通路中，但富集无显著性。本研究扩展了绵羊lncRNA数据库，为深入研究绵羊成肌细胞分化的调控机制提供了新的候选调节因子。 3.DNA甲基化调控lncRNAGTL2表达的研究 LncRNAGTL2在不同发育阶段湖羊背最长肌中差异表达，但其甲基化变化与RNA表达之间的关系尚不清楚。本研究对胎羊和成年羊背最长肌GTL2基因簇中的差异甲基化区域(DMR)进行分析，并利用基因编辑技术研究特定位点甲基化对其表达的影响。结果表明，随年龄的增长，GTL2RNA的表达水平降低;胎羊与成年羊背最长肌的全基因组亚硫酸氢盐测序分析显示，在DLK1-GTL2基因簇的DLK1和RTL1基因之间共发现7个差异甲基化区域(DMR)，它们的甲基化水平在成年羊中均显著高于胎羊;在5AZA处理的细胞中，GTL2的表达显著高于对照组，且对5AZA有剂量依赖性;此外，成功构建重组质粒dCas9-DNMT3A-sgR1和dCas9-DNMT3A-sgR2，并且它们的引入分别使细胞中GTL2的表达水平显著降低，而DNA甲基化分析表明dCas9-DNMT3A-sgR1和dCas9-DNMT3A-sgR2分别使GTL2DMR甲基化水平升高37.5％和8.9％。以上研究表明肌肉发育过程中，GTL2的表达水平受DNA甲基化调控，特别是本研究利用dCas9-DNMT3A可以实现湖羊基因组的定点甲基化并降低基因的表达水平，为进一步研究GTL2在肌细胞代谢成熟中的作用奠定了基础。 4.候选LncRNATCONS_00758916与PFKM的表达模式及UTR表达研究 为进一步验证候选lncRNA与靶基因的调控关系，本试验对候选差异表达lncRNATCONS_00758916及其靶基因PFKM进行靶向关系验证。首先，本研究分析了各组织与成肌细胞分化过程中PFKM和TCONS_00758916的表达变化;在细胞水平对TCONS_00758916进行干扰，通过qRT-PCR和WesternBlot法验证其对PFKM表达的影响;其次从湖羊肌肉组织cDNA中克隆TCONS_00758916和PFKMmRNA序列，验证其序列相关性。结果显示:在湖羊成肌细胞核质、肌管和各种组织中，TCONS_00758916与PFKM的表达趋势一致;而且干扰TCONS_00758916能够显著降低肌细胞中的PFKMRNA水平的表达;成功克隆TCONS_00758916和PFKM序列，证实TCONS_00758916来源于PFKM的3'UTR延伸。此外，还发现湖羊肌肉中数千个基因在参考基因组(Oar_v4.0)的UTR之后连续转录;而且超过66％的3'UTR延伸表现出与其上游基因相似的表达趋势，这些新的3'UTR注释扩展了哺乳动物转录后调控网络的范围。 通过以上试验，本研究筛选了湖羊肌肉三个发育阶段及成肌细胞分化过程中差异表达的lncRNA，分析了它们的表达模式和基本特征，验证了DNA甲基化对lncRNAGTL2表达的影响，此外发现候选lncRNATCONS_00758916源自PFKM的3'UTR延伸，为深入研究湖羊肌肉发育调控机制奠定了基础。 收起