摘要: 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是严重危害养猪业的传染性病原体，gB和gD糖蛋白是PRV重要的免疫原性蛋白，PRV的gB和gD蛋白的编码基因是开发PRV的重组载体疫苗的目标基因。 本文利用重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAA... 展开 伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)是严重危害养猪业的传染性病原体，gB和gD糖蛋白是PRV重要的免疫原性蛋白，PRV的gB和gD蛋白的编码基因是开发PRV的重组载体疫苗的目标基因。 本文利用重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus, rAAV)表达系统，以PRV临床变异毒株PRV/JXFC/2015株基因组为样本，通过PCR技术构建表达PRV的gB和gD糖蛋白的重组AAV2/9型腺相关病毒，并研究了该活病毒载体的生物学特性以及其对小鼠的免疫原性，该工作为开发新的PRV疫苗奠定了宝贵的基础。主要内容如下： 1.表达PRV的gB和gD糖蛋白的腺相关病毒的构建 本研究以PRV临床变异毒株PRV/JXFC/2015株基因组为样本，进行gD和gB蛋白的编码基因的PCR扩增，将gD和gB基因片段分别酶切替换连接到pAAV核心质粒上，为了便于验证表达系统的功能，我们构建得到用于包装rAAV的核心质粒是分别携带红色荧光蛋白(Mcherry)和绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的核心质粒pAAV-PRV-gD-P2A-Mcherry、pAAV-PRV-gB-P2A-EGFP。上述质粒经过酶切与测序验证正确。 2.表达PRV的gB和gD糖蛋白的腺相关病毒的制备 采用三质粒转染HEK-293T细胞制备rAAV的方法，成功制备出了表达PRV的gB和gD糖蛋白的重组AAV2/9型腺相关病毒，批号分别为rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP-Z20200103和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry-Z20200103，滴度分别是2.5×1012vg/mL和5.00×1012vg/mL。 3.表达PRV的gB和gD糖蛋白的腺相关病毒对C57小鼠的免疫试验 将rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP、rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry通过小鼠右后肢胫前肌内注射进行免疫，试验组的每组免疫5只C57小鼠，每只的免疫剂量为5×1012vg/kg，试验组分别是：第一组(rAAV-PRV-gB-P2A-EGFP )、第二组(rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry )、第三组(rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry相同剂量混合)；商品疫苗阳性对照组，免疫5只小鼠，每只的免疫剂量为10μL/g；PBS阴性对照组，免疫5只小鼠。免疫后第2，12，16，20，24，28周采血，用野毒PRV/JXFC/2015毒株检测血清中和抗体水平。并对免疫后第28周采血收集的血清样本，进行PRV/JXFC/2015野毒株和CH-18野毒株交叉中和试验。 小鼠血清中和抗体实验的结果表明：针对PRV/JXFC/2015野毒株的病毒血清中和抗体检测，阴性对照PBS组以及rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP组的所有时间点的5只小鼠的混合血清的中和抗体水平为0，其中rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry相同剂量混合注射组的混合血清的中和抗体水平分别是1∶8、1∶19.95、1∶22.9、1∶5.6、1∶5.01、1∶31.6；阳性对照商品疫苗组的混合血清的中和抗体水平分别是1∶16、1∶16、1∶16、1∶16、1∶16、1∶22.38；rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组的混合血清的中和抗体水平分别是1∶5、1∶64、1∶32、1∶44、1∶39.8、1∶56.2。对28周的混合血清做的针对CH-18野毒株的交叉中和检测，rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP组混合血清中和抗体水平为0，rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组混合血清中和抗体水平≥1:256，rAAV2/9-PRV-gB-P2A-EGFP和rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组的混合血清的中和抗体水平为1:89.125，阳性对照商品疫苗组混合血清的中和抗体水平为1:42，阴性对照PBS组的混合血清的中和抗体水平为0。 进一步的测定各组在各个时间点的5只小鼠的混合血清中的IFN-γ、IL-4细胞因子含量，结果显示，rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组最高为1973.65pg/mL的IFN-γ水平和161.01pg/mL的IL-4水平，商品疫苗IFN-γ水平最高为1959pg/mL，IL-4水平最高为103.89pg/mL。细胞因子测定实验结果表明rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组产生出了比商品疫苗组更高的免疫细胞因子表达水平。总之，rAAV2/9-PRV-gD-P2A-Mcherry组在试验中效果显著，通过单针免疫小鼠后，在小鼠体内激发了非常明显并且持久的体液免疫与细胞免疫应答，达到较长的免疫效力保护周期和更高的持续保护效力。 收起