摘要: 犬瘟热病毒（CDV）感染可引起多种食肉动物的群体性死亡，是目前困扰宠物行业的主要病毒之一。为了进行有效的免疫防控，国内外主要通过接种弱毒疫苗的方式阻止该病的流行。虽然目前通过预防接种很大程度上减少了犬瘟热的流行，但免疫力低下的易感动物... 展开 犬瘟热病毒（CDV）感染可引起多种食肉动物的群体性死亡，是目前困扰宠物行业的主要病毒之一。为了进行有效的免疫防控，国内外主要通过接种弱毒疫苗的方式阻止该病的流行。虽然目前通过预防接种很大程度上减少了犬瘟热的流行，但免疫力低下的易感动物仍然抵抗不了强毒的攻击，从而感染患病。患病犬只能通过特异性高免血清、单克隆抗体、免疫球蛋白等配合抗病毒药物进行综合治疗。在感染早期得到治疗的患病犬，治愈率可达70%，而感染中后期的治愈率最高仅有50%，且上述治疗方法治疗成本昂贵、中小城镇普及率低，因而无法广泛使用。而卵黄抗体作为另一类免疫球蛋白，具有生产成本低廉、产出高效、稳定性高和对动物福利的损害更小等优势，这为临床上开发治疗犬瘟热的平价生物制剂提供了新思路。 本课题将重组腺相关病毒（rAAV）安全和长效的优势与卵黄抗体结合，建立一种制备卵黄抗体的新方法，并制备抗犬瘟热的卵黄抗体，随后对卵黄抗体进行中和抗体效价测定和活性影响因素研究，主要获得以下结果： 1.利用重组腺相关病毒建立制备抗犬瘟热卵黄抗体的新方法 本研究基于实验室前期构建的携带犬瘟热病毒H基因、F基因的腺相关病毒的质粒，通过病毒包装得到带有目的抗原的重组腺相关病毒（rAAV-CDV-H-HA、rAAV-CDV-F-HA）。在细胞水平检测rAAV所携带的抗原基因可稳定表达后，大批量包装病毒，免疫正处于产蛋旺盛期的白羽蛋鸡。 2.抗犬瘟热卵黄抗体的制备及其检验 免疫蛋鸡后，采用聚乙二醇沉淀法提取的rAAV-CDV-H、rAAV-CDV-F卵黄抗体浓度较高，测定的卵黄抗体浓度范围在13~26mg/mL之间，其中rAAV-CDV-H卵黄抗体浓度普遍高于rAAV-CDV-F卵黄抗体。SDS-PAGE电泳试验验证得到卵黄抗体相对质量与理论一致且纯度较高，细胞间接免疫荧光验证得到抗体特异性良好。 3.抗犬瘟热卵黄抗体的中和效价测定及其活性影响因素研究 中和试验结果显示，rAAV-CDV-H实验组能够产生较高水平的抗犬瘟热病毒的中和抗体。随着免疫的逐渐加强，中和抗体水平逐渐升高，最高时达到1∶300；而rAAV-CDV-F实验组的中和抗体水平较低，均低于1∶50。卵黄抗体活性影响因素研究结果显示，卵黄抗体对温度的敏感性较低；而对酸碱度的敏感性较高。卵黄抗体在模拟的人工胃液环境下，无法抵抗胃蛋白酶的消化作用；而在模拟的人工肠液环境下，对胰蛋白酶的消化作用有较强的抵抗力。 综上所述，以重组腺相关病毒为载体免疫白羽蛋鸡，可有效激活白羽蛋鸡的免疫系统并产生高水平的中和抗体，说明成功建立利用重组腺相关病毒制备卵黄抗体的方法。通过对抗犬瘟热卵黄抗体的检测与评估，进一步说明利用该方法可获得特异性好、免疫效果佳、稳定性较好的卵黄抗体。本课题为制备高效、低成本和稳定性高的卵黄抗体提供了新的手段，并为进一步研究可以用于犬瘟热预防和治疗的卵黄抗体探索了制造抗体的方法。 收起