摘要: 前 言 单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)性角膜炎是一种严重的世界性致盲性眼病,HSV感染眼部后,病毒会在三叉神经节建立一种长久的潜伏状态,从而造成患者的反复感染[1],因此,研制预防HSV感染、潜伏和复发的疫苗具有重要意义。本研究利用生物... 展开 前 言 单纯疱疹病毒(Herpes Simplex Virus,HSV)性角膜炎是一种严重的世界性致盲性眼病,HSV感染眼部后,病毒会在三叉神经节建立一种长久的潜伏状态,从而造成患者的反复感染[1],因此,研制预防HSV感染、潜伏和复发的疫苗具有重要意义。本研究利用生物信息学软件分析gB和gD蛋白抗原表位,设计两者抗原表位串联基因,利用大肠杆菌质粒构建该基因的表达载体,在大肠杆菌中表达了该蛋白并进行了鉴定。 材料和方法 1、材料 (1)质粒及菌种 表达载体PET-28a,大肠杆菌JM109,表达菌BL21(DE3)感受态细胞。 (2)分子生物学试剂Polymerase Taq DNA聚合酶、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、卡那霉素,DNA标志物DL2000,质粒抽提试剂盒、DNA胶回收试剂盒,XhoI、EcoRI内切酶,T4 DNA连接酶,预染蛋白质分子量标准,及其余进口或国产分析纯以上级试剂。PCR引物由上海生工生物工程技术服务公司合成。 2、方法 (1)gB、gD糖蛋白抗原表位串联基因的设计与合成 应用生物信息学分析软件laser gene DNASTAR分析gB、gD蛋白抗原表位,设计表串联序列,根据遗传密码设计表位串联基因,并附加His标签,命名为X基因,由上海生工公司合成并测序。 (2)X基因表达载体的构建 以X基因DNA为模板,进行PCR扩增并回收纯化PCR产物。将用限制性内切酶XhoI及EcoRI处理后的X基因片段的PCR.产物和PET28(a)载体连接获得表达载体PET-X,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性克隆并鉴定。 (3)X基因的表达 将含有PET-X重组质粒的阳性克隆BL21(DE3)大肠杆菌进行培养并留取阴性对照,加入IPTG诱导表达[4],分别收集诱导表达后1h、2h、3h的菌液,将各组样品进行SDS-PAGE电泳检测。 (4)重组蛋白的Western Blotting鉴定 分别以Penta-His Antibody和HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗体为第一、第二抗体进行重组蛋白的Western Blotting鉴定。 3、结果 (1)gB、gD糖蛋白抗原表位串联基因的设计与合成 应用laser gene DNASTAR软件分析选取了gB、gD糖蛋白的9个抗原表位,设计重组表位串联基因,长1299bp,编码433氨基酸残基,命名为X基因。 (2)X基因的PCR扩增 取PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测,结果显示,扩增出一条特异的、大小约为1300bp的DNA片段,与预期的大小(1299bp)基本一致,初步证实PCR产物为目的基因片段,获得的PCR产物经序列测定为正确的X基因。 (3)X基因表达质粒PET-X的构建与鉴定 将重组的PET-X质粒经限制性内切酶XhoI和EcoRI酶切,初步鉴定构建成功。构建的PET-X质粒进行碱基序列测序,证明插入的序列符合设计方案,测序由大连宝生物公司完成。 (4)重组蛋白X的表达 将阴性对照组和分别经IPTG诱导1h、2h、3h后的重组菌裂解液进行SDS-PAGE电泳检测,可见相对分子质量(Mr)约47kD处的蛋白条带,与预期的47.5kD目的蛋白相符,未经诱导的对照组该蛋白条带较细,而诱导1h、2h、3h组该处蛋白条带明显增粗,可初步证明重组表达载体有X蛋白的表达,该条带即为重组菌的表达带。 (5)重组蛋白X的Western Blotting鉴定 将IPTG诱导表达前后的菌体裂解液经Western Blotting鉴定,结果表明,在诱导后1h、2h、3h组均出现了His标签阳性的识别条带,大小约47kD,而阴性对照组则未见条带,表明经IPTG诱导后重组表达体PET-X表达出了含His标签的约47.5kD大小的目的蛋白,且不同表达时间所表达的蛋白量大致相当,而未经IPTG诱导的阴性对照组则几乎未表达出目的蛋白。 结 论 1、构建了新型HSV抗原表位串联基因； 2、表达并初步鉴定了HSV抗原表位串联蛋白,为HSV疫苗的研究提供了新型抗原蛋白。 收起