摘要: 牛传染性鼻气管步(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus,IBRV)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病,临床上主要以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征,还能引起... 展开 牛传染性鼻气管步(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus,IBRV)引起的一种牛的急性、热性、接触性传染病,临床上主要以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征,还能引起母牛流产和死胎、肠炎和小牛脑炎,有时发生眼结膜炎和角膜炎.该病在世界范围内流行,并且每年都给养牛业造成巨大的经济损失,鉴于传统疫苗存在的弊端及该病毒的特点,近年来对活病毒载体疫苗的研究受到了更大的关注.本研究构建了一株牛传染性鼻气管炎病毒gc基因缺失的重组病毒,为构建表达外源基因的IBRV重组病毒及研制牛病活载体疫苗奠定了基础.同时截短表达了IBRV的gD糖蛋白,所表达的蛋白具有良好的反应性,可用于IBRV诊断试剂与亚单位疫苗的研究. 本实验根据牛传染性鼻气管炎病毒全基因组序列(基因登陆号为NC 001847)设计引物,用PCR扩增gc基因上游和下游各1.4kb的片段作为同源重组臂,分别连入pMD18-T载体,并命名为pUgC和pDgC.限制性酶切和测序鉴定正确后,用Xba Ⅰ和Nsi Ⅰ消化pUgC,将得到的的上游重组臂定向克隆于pdTK质粒,pdTK质粒中含有LacZ基因表达盒,可以通过蓝白斑筛选及酶切鉴定得到阳性克隆质粒,再用Asu Ⅱ和 Kpn Ⅰ消化此质粒,回收带有上游重组臂的大片段后与用Asu Ⅱ和Kpn Ⅰ消化pDgC得到的下游重组臂连接得到pdgC<'->/LacZ<'+>重组质粒转移载体.其中LacZ基因正好位于gC启动子的下游,LacZ基因编码氨基酸前面有25个由gC起始密码子ATG在内的75个核苷酸编码的氨基酸残基.采用磷酸钙-DNA沉淀法将经AsuⅡ线性化的pdgC<'->/LacZ<'+>质粒转移载体和IBRV全基因组DNA共转染牛鼻甲细胞(BT),待细胞病变达80%后收获病毒,按1:6倍比稀释病毒,接种MDBK细胞单层,用1%甲基纤维素限定细胞病变.待出现明显的病毒蚀斑后,用加有X-gal的1%低熔点琼脂糖覆盖后挑取病毒蓝斑,经6代篮色蚀斑筛选纯化及PCR鉴定得到稳定增殖的重组病毒rIBRV gC<'->/LaeZ<'+>. gD糖蛋白位于病毒囊膜及感染细胞的表面,其作为抗原产生的抗体中和病毒效果最好,成为研制亚单位疫苗的首选蛋白.本实验利用生物学软件DNAStar分析,以IBRV(Bartha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增出gD基因943bp的片段,然后将此目的片段定向克隆到pET30a表达载体中.经酶切和测序鉴定得到阳性重组质粒pET30a-tgD,然后将其转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶性表达的重组蛋白(tgD).采用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下成功地纯化了重组蛋白(tgD),纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/ml,纯度为85.2%.Western blot和ELISA检测证明纯化后的重组蛋白(tgD)可以被牛传染性鼻气管炎病毒抗血清所识别,具有良好的反应性,可以进一步开发研制牛传染性鼻气管炎诊断试剂及亚单位疫苗. 收起