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国家工程技术图书馆
2022年11月29日
摘要: 背景: 食管癌是全球发病率排名前10位、致死率不断攀升的恶性肿瘤,呈明显地域分布差异,是河南等地区发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。发生在中国的食管癌95%以上病理类型为食管鳞癌,这与西方绝大部分为食管腺癌迥然不同。目前食管鳞癌具体的... 展开 背景: 食管癌是全球发病率排名前10位、致死率不断攀升的恶性肿瘤,呈明显地域分布差异,是河南等地区发病率和致死率最高的恶性肿瘤之一。发生在中国的食管癌95%以上病理类型为食管鳞癌,这与西方绝大部分为食管腺癌迥然不同。目前食管鳞癌具体的发病机制尚不完全清楚,最近的基因组测序显示Hippo信号通路的失调可能是食管鳞癌进展的关键因素。我们在前期研究中,通过沉默食管鳞癌细胞系中的RACO-1(Ring Domain AP-1 Co-Activator 1)可调节YAP蛋白的稳定性,认为RACO-1是Hippo信号通路的一种新的调节因子,因此,进一步探讨RACO-1调控Hippo信号通路和YAP蛋白转运机制,对提高食管鳞癌的早期诊断和靶向治疗具有重要意义。 目的: 探讨RACO-1在食管鳞癌中调节Hippo信号通路的作用机制,为食管鳞癌的早期筛查和特异性治疗靶点提供新的思路。 方法: 1.通过沉默食管鳞癌细胞系中的RACO-1,用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction , qRT-PCR )和蛋白印记法(Western blot)方法检测沉默组细胞与对照组细胞中mRNA水平和蛋白水平表达情况,确定沉默效率。 2.应用细胞划痕实验和Transwell实验评估RACO-1对食管鳞癌细胞修复能力和迁移能力的影响。 3.通过WST实验检测细胞的增殖情况,明确RACO-1对食管鳞癌细胞增殖能力的影响。 4.通过免疫共沉淀实验(Co-IP)及免疫荧光共定位实验明确RACO-1与YAP在食管鳞癌细胞内的定位情况及两者的关联性。 5.在食管鳞癌细胞系中沉默RACO-1,通过Westernblot和qRT-PCR实验检测实验组与对照组中YAP蛋白水平和YAP靶基因mRNA水平表达情况。 6.通过Rescue实验,观察沉默RACO-1之后食管鳞癌细胞侵袭和迁移与Hippo信号通路改变的相关性。 7.通过MG132、CHX及泛素化实验探讨RACO-1是否通过泛素化途径影响YAP蛋白稳定性。 结果: 1.沉默食管鳞癌细胞系中的RACO-1,结果显示其蛋白水平和mRNA水平较对照组相比明显下降(P<0.05),提示沉默成功。 2.在食管鳞癌细胞系中沉默RACO-1后,行划痕实验观察到实验组与对照组相比愈合速度增快,迁移能力增加(P<0.05),Transwell实验观察到沉默组与对照组相比迁移能力明显增加(P<0.05)。 3.WST实验证明RACO-1的缺失抑制了食管鳞癌细胞的增殖速度。 4.免疫共沉淀实验显示食管鳞癌细胞中RACO-1与YAP存在内源性联系。免疫荧光共定位实验表明RACO-1与YAP在食管鳞癌细胞内存在共同的定位。 5.食管鳞癌细胞中RACO-1的缺失增加了YAP蛋白水平的表达,同时可以看到YAP的靶基因CTGF和CYR61mRNA水平升高(P<0.05)。 6.Rescue实验结果表明沉默RACO-1引起的食管鳞癌细胞侵袭和迁移的增加可以通过进一步的沉默YAP来挽回。 7.MG132实验、CHX实验及泛素化实验表明RACO-1可以通过泛素化途径对YAP蛋白的稳定性起到调控作用。 结论: RACO-1作为一种内源性Hippo/YAP信号的抑制剂,可经泛素化途径调节Hippo/YAP信号通路而抑制食管鳞癌细胞的迁移和侵袭。调控RACO-1的活性或表达可能成为食管鳞癌患者早期诊断和治疗的可行策略。 收起
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