摘要: 目的:胶质瘤(glioma)是人类最常见的颅内原发恶性肿瘤。主要源自神经上皮，具有起病隐匿、复发率高、致死率高和治愈率低等特点。即便行手术及术后正规的放化疗等治疗手段，治疗效果和潜力均有限。肿瘤的发生、发展是一个多重的、渐进的复杂过程，其中... 展开 目的:胶质瘤(glioma)是人类最常见的颅内原发恶性肿瘤。主要源自神经上皮，具有起病隐匿、复发率高、致死率高和治愈率低等特点。即便行手术及术后正规的放化疗等治疗手段，治疗效果和潜力均有限。肿瘤的发生、发展是一个多重的、渐进的复杂过程，其中涉及细胞黏附、迁移、增殖和侵袭等环节。寻找调控胶质瘤发生的分子机制及重要靶点，有助于开发新的基因治疗等措施手段。Rap家族属Ras超家族旗下，有文献报道Rap2a及Rap2b参与肿瘤的发生发展，但关于Rap2c的研究报告甚少，目前尚未发现有文献报道其在胶质瘤的发生发展中是否发挥生物学作用。本研究利用siRNA转染、慢病毒感染、真核表达质粒转染等技术来上调或下调人胶质瘤细胞Rap2c蛋白的表达水平，通过CCK8增殖实验、流式细胞技术、Transwell小室迁移和侵袭实验、异体移植瘤等检测胶质瘤细胞株U87和U118相关生物学行为的改变，在体和离体水平深入探讨Rap2c与胶质瘤发生发展之间的关系。 方法:第一部分:Westernblot方法检测胶质瘤组织及细胞中Rap2c蛋白表达;收集15例正常脑组织和180例人胶质瘤组织，采用免疫组化技术检测Rap2c在正常脑组织及胶质瘤组织的表达，并通过量化分析Rap2c免疫组化染色评估其与胶质瘤患者临床病理指标及与患者术后生存时间的关系。 第二部分:构建pcDNA3.1-Rap2c真核表达质粒。采用pcDNA3.1-Rap2c质粒转染方法(Rap2c:Rap2c过表达组;Vector:空质粒对照组)和RNA干扰技术(siCtrl:对照组;siRap2c:Rap2c干扰组)构建过表达和低表达Rap2c的胶质瘤细胞U87和U118，用CCK-8实验检测转染后胶质瘤细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞凋亡变化，Transwell实验检测细胞迁移能力。Westernblot技术检测空质粒组和Rap2c过表达组两组胶质瘤细胞U87、U118迁移和侵袭相关蛋白E-cadherin，Vimentin等蛋白的表达，并初步探讨其相关机制。 第三部分:通过慢病毒技术构建稳定表达Rap2c的U87胶质瘤细胞系(LV-Ctrl:对照组;LV-Rap2c:实验组)，建立BALB/c小鼠胶质瘤转移瘤模型，分别将转染Rap2c慢病毒和转染空载体的胶质瘤细胞U87经超微注射器由尾静脉缓慢注入裸鼠尾部，观察两组肿瘤生长情况和重量比较。采用免疫印迹方法检测迁移侵袭相关蛋白E-cadherin及p-ERK蛋白的表达情况。 结果:Rap2c在胶质瘤细胞株和组织中的蛋白表达量均增高。Rap2c高表达胶质瘤病人5年生存率明显下降。Rap2c过表达可增强胶质瘤细胞株U87和U118的迁移侵袭能力，但对细胞的增殖凋亡无明显影响。反之，下调Rap2c的表达可使胶质瘤细胞的迁移侵袭能力明显下降。且Rap2c的促迁移侵袭能力可能与ERK信号通路的激活有关。与此同时，在体的裸鼠转移模型证实Rap2c通过ERK信号通路促进胶质瘤细胞体内肺转移。 第一部分1.Westernblot结果显示，胶质瘤细胞系U87、U251和U118中Rap2c的蛋白表达分别为1.65±0.23，1.51±0.06，1.52±0.12，明显高于对照组(1.00±0.16)。同样，胶质瘤组织的Rap2c的表达(2.18±0.21)明显高于正常脑组织中Rap2c1.00±0.12(P＜0.01)。2.组织芯片检测结果进一步证实，与正常脑组织相比，胶质瘤组织中的Rap2c的表达明显增高，尤其在Ⅳ型胶质瘤组织中的表达尤为明显，但Ⅰ、Ⅱ型和Ⅲ、Ⅳ型胶质瘤之间Rap2c的表达没有显著性差异。3.Kaplan-Meier生存曲线提示，Rap2c高表达与胶质瘤患者5年生存率降低有关(P＜0.05)。但Rap2c的高表达与胶质瘤病人的年龄、性别、WHO级别以及肿瘤的病理类型没有明显相关性。 第二部分1.以真核表达载体pcDNA3.1(+)为骨架，构建Rap2c质粒，测序结果提示质粒构建成功。2.转染Rap2c质粒后，U87细胞中Rap2c蛋白的表达为2.63±0.24，明显高于空载体组1.00±0.09，差异有统计学意义(P＜0.01);同样地，转染Rap2c质粒后U118中Rap2c蛋白表达量(2.08±0.12)明显高于空载体组(1.00±0.08)，提示Rap2c在U87和U118胶质瘤细胞中均过表达成功。与空载体组比较，转染Rap2c的过表达组U87细胞450nm处的吸光度值无明显增高(P＞0.05);在U118细胞中同样发现Rap2c高表达对细胞增殖无明显影响(P＞0.05)。U87细胞空载体组与Rap2c过表达组的凋亡率分别为1.72±0.12％和1.83±0.19％;U118细胞的两组凋亡率分别为2.38±0.24％和2.29±0.28％，提示两种细胞空载体组和Rap2c过表达组的细胞凋亡率无显著统计学差异。在划痕实验中，与空载体组100.00±12.50％相比，Rap2c过表达组U87细胞的迁移数目达到152.10±11.21％。Rap2c过表达组U118细胞迁移数目294.90±19.33％，远大于空载体组的100.00±9.16％，P＜0.05。在Transwell小室迁移实验中，与空载体组(100.00±4.04％)相比，Rap2c过表达组U87细胞迁移百分比(186.33±15.62％)显著增加，P＜0.05;U118细胞的Rap2c过表达组迁移细胞的百分比(144.67±14.89％)显著高于空载体组(100.00±9.00％)。Transwell细胞侵袭实验中，U87细胞Rap2c过表达组细胞穿透百分比为287.67±26.42％，与空载体组的100.00±5.69％相比明显增多，P＜0.05。与U118细胞的Rap2c过表达组侵袭细胞的百分比(230.33±10.18％)相比，空质粒组的侵袭细胞百分比仅100.00±8.39％。3.Rap2cRNA干扰后U87和U118细胞Rap2c蛋白表达含量分别为0.47±0.09、0.23±0.05，显著低于对照组的1.00±0.11、1.00±0.09，差异有统计学意义(P＜0.05)。在细胞增殖实验，与对照组相比，Rap2cRNA干扰实验组的吸光度值也未有明显变化。Rap2cRNA干扰后U87和U118的凋亡率分别为3.89±0.27％和4.11±0.08％，与对照组4.17±0.32％，3.92±0.12％相比亦无显著差异。在划痕实验中，与对照组相比，Rap2cRNA干扰组U87和U118细胞的迁移数目显著下降，P＜0.05。在Transwell细胞迁移实验中，与对照组(100.00±5.13％)相比，Rap2c干扰组U87细胞的百分比(30.33±8.96％)显著降低，P＜0.05;U118细胞的Rap2c干扰组迁移细胞的百分比(50.67±4.04％)明显低于空载体组(100.00±12.46％)。Transwell细胞侵袭实验中，U87细胞Rap2c干扰组细胞穿透百分比为48.00±6.00％，与对照组的100.00±9.99％相比，明显减少，P＜0.05。与U118细胞对照组的侵袭细胞百分比的100.00±10.70％相比，Rap2c干扰组侵袭细胞的百分比仅33.33±4.16％。4.与空质粒组相比，Rap2c过表达后U87、U118细胞中E-cadherin表达明显减少，而Vimentin的蛋白表达显著增多(P＜0.05)。且Rap2c过表达可使MEK和ERK的磷酸化水平增高(P＜0.05)。5.运用MEK信号通路阻滞剂U0126可消除Rap2c过表达引起的ERK磷酸化水平增高，并抑制U87和U118细胞的迁移侵袭能力。 第三部分1.BALB/c小鼠转移模型证实Rap2c促进胶质瘤细胞体内肺转移。对照组肺转移结节个数为12.75±4.74，而Rap2c慢病毒转染组肺转移结节个数为29.63±6.59，远高于对照组，P＜0.05。与对照组小鼠肺重量119.88±7.81mg相比，Rap2c转染组的肺重量达148.13±12.69mg，P＜0.05。肺组织经westernblot检测，Rap2c转染组的E-cadherin表达明显减少，而磷酸化ERK水平增高，P＜0.05。 结论:1.Rap2c在胶质瘤中高表达，可作为胶质瘤病人的预后因子。2.Rap2c可以促进胶质瘤细胞的迁移、侵袭能力，但不影响胶质瘤细胞的增殖和凋亡。3.Rap2c能够磷酸化ERK，而磷酸化的ERK通过影响E-cadherin，Vimentin促进胶质瘤细胞的迁移侵袭。4.Rap2c具有促进胶质瘤细胞成瘤的能力，推测可能成为胶质瘤治疗的新的靶点。 收起