摘要: 研究背景： 胃癌是一个全球性的健康问题，目前是世界第五大最常诊断的肿瘤，位列肿瘤死因第三位。它是我国第二常见的肿瘤，位列肿瘤死因第二位。临床上，晚期胃癌预后差，5年总生存率仅15%。分子靶向治疗是近年来胃癌治疗研究的热点。肝细胞生长... 展开 研究背景： 胃癌是一个全球性的健康问题，目前是世界第五大最常诊断的肿瘤，位列肿瘤死因第三位。它是我国第二常见的肿瘤，位列肿瘤死因第二位。临床上，晚期胃癌预后差，5年总生存率仅15%。分子靶向治疗是近年来胃癌治疗研究的热点。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)是一种具有多效性的细胞因子，在促进血管生成、免疫应答、细胞运动和细胞分化方面具有重要作用。HGF在多种肿瘤中表达上调，与肿瘤的发生发展密切相关。 微小核糖核酸(microRNAs, miRNAs)是长约22个核苷酸、高度保守、非编码的RNA分子，通过关闭基因或者在转录后水平抑制mRNA翻译或介导mRNA的降解来调节基因表达。miRNAs可以靶向与癌症生理、病理特征几乎所有方面密切相关的靶点，在肿瘤的发生和进展中扮演重要角色。 我们的前期研究结果显示，与健康人群相比，miR-15a/16/195在胃癌患者的血清中表达降低，且表达量与胃癌分期具有相关性，分期越晚，降低越明显。提示miR-15a/16/195在胃癌中发挥抑癌作用，但其潜在机制有待明确。 研究目的： 本研究目的在于明确miR-15a/16/195在胃癌中的表达水平，并验证其对胃癌细胞增殖、迁移功能的影响；明确HGF在胃癌中的表达水平，探索miR-15a/16/195对HGF的靶向调控作用并验证miR-15a/16/195-HGF轴对于胃癌细胞迁移、增殖功能的影响，为胃癌靶向治疗提供新的理论依据。 研究方法： 1.胃癌患者术后组织：收集天津医科大学肿瘤医院胃癌患者术后癌组织及配对癌旁组织，使用免疫组化(IHC)和免疫印迹(WB)方法检测HGF蛋白表达水平，利用高通量测序筛选胃癌特异的miRNA，并使用qRT-PCR检测HGFmRNA及miR-15a/16/195表达水平。 2.靶点预测：使用三种生物信息学软件PicTar、miRanda和TargetScan预测靶向HGFmRNA的潜在miRNA，并取交集。 3.荧光素酶报告基因实验：验证miR-15a/16/195与HGFmRNA的直接结合。 4.胃癌细胞系：研究miR-15a/16/195-HGF通路对胃癌细胞迁移及增殖的作用。使用WB检测HGF蛋白表达。使用qRT-PCR方法检测HGFmRNA及miR-15a/16/195表达水平。使用细胞划痕实验和Transwell实验检测胃癌细胞迁移能力，使用EdU实验检测胃癌细胞的增殖能力。 5.胃癌裸鼠移植瘤模型：进一步验证miR-15a/16/195-HGF通路对胃癌细胞迁移及增殖的作用。将对照组SGC7901、分别过表达miR-15a/16/195和HGF的SGC7901植入裸鼠皮下，4周后处死，剥离肿瘤。测量肿瘤直径、重量，检测瘤组织中miR-15a/16/195及HGF表达水平。 研究结果： 1.胃癌患者术后组织：与邻近正常组织相比，胃癌组织中miR-15a/16/195表达水平明显降低，HGF表达水平明显升高。HGFmRNA在癌组织和邻近正常组织中表达水平无明显差异。 2.靶点预测：使用生物信息学软件预测miR-15a/16/195是可能靶向HGFmRNA的潜在miRNA，miR-15a/16/195可与HGF的3’-UTR区域特异结合。 3.荧光素酶报告基因实验验证：在野生型HGF中，miR-15a/16/195mimics处理组荧光值显著降低，而miR-15a/16/195inhibitors处理组中，荧光值显著升高。在突变型HGF中，miR-15a/16/195mimics、NCmimics、miR-15a/16/195inhibitors、NCinhibitors四种处理组，荧光均都无明显变化。结果证实miR-15a/16/195可以靶向抑制HGF表达，二者呈负向调控的关系。 4.胃癌细胞系：转染miR-15a/16/195mimics和miR-15a/16/195inhibitors后，可以过表达或者沉默miR-15a/16/195的表达。细胞功能实验证实过表达miR-15a/16/195后，可以抑制胃癌细胞系SGC7901的迁移、增殖能力；相反，沉默miR-15a/16/195后，可以促进胃癌细胞的迁移、增殖。过表达/沉默miR-15a/16/195后，可以下调/上调HGF的表达，而HGFmRNA的表达水平没有变化。转染pcDNA.HGF(OE.HGF)和siRNA.HGF(si.HGF)，可以过表达或者沉默HGF的表达。过表达HGF后，可以促进胃癌细胞系SGC7901的迁移、增殖能力；相反，沉默HGF后，可以抑制胃癌细胞的迁移、增殖。回复实验：同时高表达miR-15a/16/195和HGF，与仅miR-15a/16/195高表达的细胞相比，HGF蛋白表达升高，但是低于OE.NC对照组，即可以部分拯救HGF蛋白表达。同时高表达组由于转染OE.HGF，HGFmRNA水平增高，而miR-15a/16/195高表达组和对照组，HGFmRNA水平无变化。回复实验也可以部分挽救SGC7901的迁移、增殖能力。 5.胃癌裸鼠移植瘤模型：与未经干预的对照组相比，过表达miR-15a/16/195细胞成瘤组织中，miR-15a/16/195水平上调，HGF蛋白表达降低，肿瘤最小；过表达HGF细胞成瘤组织组，miR-15a/16/195水平无变化，HGF蛋白表达升高，肿瘤最大，生长最快。与细胞实验的结果一致。 研究结论： miR-15a/16/195通过靶向HGF抑制胃癌细胞的迁移及增殖。 收起