摘要: 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，简称iPSC）是将体细胞内加入特定的因子重编程形成的。因其具有自我更新及向三胚层分化的能力，具有建立疾病模型、药物筛查以及个体化再生医学的应用前景。目前iPSC来源NK细胞以及iPSC制备肿瘤疫苗... 展开 诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，简称iPSC）是将体细胞内加入特定的因子重编程形成的。因其具有自我更新及向三胚层分化的能力，具有建立疾病模型、药物筛查以及个体化再生医学的应用前景。目前iPSC来源NK细胞以及iPSC制备肿瘤疫苗均为抗肿瘤领域研究热点，然而由于iPSC重编程过程具有时间长、效率低的技术瓶颈；且因应用转录因子c-Myc，存在潜在致癌风险；另外需要应用病毒载体，可能发生基因组不稳定，极大限制其应用于临床。科学家尝试通过作用于Wnt信号传导通路、ERK/MAPK信号传导通路、生物材料等方面改良iPSC重编程过程，但取得的效果差强人意。只有深入研究iPSC重编程机制，方能打破技术瓶颈，优化iPSC形成过程，促进其临床转化。iPSC在重编程过程中发生独特的表观遗传学改变，包括DNA去甲基化、组蛋白修饰、染色质内环结构形成等。近期研究发现长链非编码RNA（long non-coding RNA，简称lncRNA）在细胞分布表现出较强的特异性，在诸多病理及生理过程中扮演重要的角色，同样也参与调节干细胞的多能性及分化能力。LncRNA通过与染色质DNA结合、招募调控因子、改变DNA表观修饰等方式进行表观遗传学调控。 研究目的： 寻找与干细胞多能性相关的lncRNA，研究其调控干细胞多能性的分子机制，探索以lncRNA为媒介达到操纵和控制细胞命运，推动iPSC临床转化。 研究方法： LncRNA筛选：首先结合“染色质lncRNA原位逆转录测序”（chromatin RNA in situ reverse transcription-associated trap sequencing，简称CRIST-Seq）及成纤维细胞（fibroblasts，简称FBC）与iPSC RNA-Seq对比技术，筛选出与多能基因Oct4启动子结合的多能性相关lncRNA。通过核内核外实验以及RNA FISH检测确定lncRNA的亚细胞定位。 LncRNA功能研究：应用拟胚体实验，观察lncRNA与细胞多能性的关系。应用shRNA敲低实验检测lncRNA及多能性基因Oct4、Sox2、Nanog表达水平，观察细胞形态变化。应用过表达实验，检测体外及体内过表达lncRNA后是否促进多能性基因表达。通过诱导重编程实验，明确lncRNA过表达是否提高重编程效率。 LncRNA机制研究：应用“逆转录相关捕获实验”（reverse transcription associated trap sequencing，简称RAT）技术确定lncRNA全基因结合靶点，应用RNA-DNA FISH明确lncRNA与靶点的空间位置关系。应用3C技术确定lncRNA对染色质内环结构影响，进而应用RIP以及RNA结合技术明确lncRNA是否可招募SMC1以及具体结合片段。检测过表达lncRNA的成纤维细胞多能基因启动子区甲基化水平，应用RIP技术明确lncRNA是否招募去甲基化酶，通过RNA mapping技术明确具体lncRNA与去甲基化酶结合位点。 研究结果： LncRNA筛选：通过结合CRIST-Seq结果及FBC与iPSC的RNA-Seq结果，筛选出同时满足以上两项条件的lncRNA Oplr16。lncRNA Oplr16作为一条全新的长链非编码RNA，至今没有任何相关报道。Oplr16全长629bp，位于小鼠17号染色体上。Oplr16仅在脂肪及肝脏中有极少量表达，在其余组织中无表达，说明Oplr16在干细胞中具有表达特异性。通过核内核外实验以及RNA FISH发现Oplr16主要分布于细胞核内。 Oplr16功能研究：拟胚体实验结果显示Oplr16与Oct4、Sox2及Nanog这些重要的多能性基因一样，随着细胞的分化表达下降。应用shRNA对Oplr16进行敲低实验，伴随着Oplr16敲低后，细胞多能性因子Oct4、Sox2及Nanog的表达量也显著降低。成功转染shOplr16的iPSC形态发生变化，趋于分化，失去SOX2多能性标志物，而转染sh-CT的iPSC形态保持正常，SOX2多能性标志表达良好。Luciferase实验显示过表达Oplr16的质粒组荧光素酶活性较空白质粒组及随机lncRNA质粒组提高近8倍。转染Oplr16过表达质粒的FBC中Oct4转录水平升高4倍余。经转染Oplr16过表达质粒，DOX-OSKM-MEFs重编程系统会形成更多的iPSC克隆。 Oplr16机制研究：应用RAT技术显示Oplr16在Oct4启动子区显著富集，定量PCR进一步证实Oplr16在Oct4启动子区大量富集。RNA-DNA FISH发现Oplr16与Oct4空间上毗邻。应用3C技术明确Oplr16在维持Oct4染色质内环结构中发挥作用。转染shOplr16质粒的iPSC，Oct4染色质内环结构显著减少。SMC1RIP技术显示Oplr16与SMC1相互作用，SMC1-RNA结合实验提示Oplr163’端与SMC1相互作用。转染Oplr16过表达质粒的FBC，其Oct4启动子区CpG岛发生去甲基化的比率显著高于转染空白对照质粒及随机对照质粒组。转染Oplr16过表达质粒后，Tet2的表达水平显著升高。TET2RIP技术检测到Oplr16与DNA去甲基化酶TET2相作用。通过RNA mapping技术提示Oplr163’端与TET2相结合。过表达失去3’端Oplr16并不会改变Oct4启动子区CpG岛甲基化比率。 研究结论： Oplr16是多能性相关的全新lncRNA，在iPSC中特异性高表达。基因水平敲低Oplr16会导致干细胞多能性消失，发生分化。过表达Oplr16会提高重编程效率。Oplr16通过激活细胞内源性多能性基因Oct4，结合SMC1蛋白促进染色质内环结构形成，调控Tet2基因并且招募TET2蛋白诱导DNA去甲基化等多种表观遗传学机制调控干细胞多能性。 收起