摘要: 背景 胰腺癌（Pancreaticductaladenocarcinoma，PDAC)是世界范围内最难的恶性消化道肿瘤，每年有超过35万人被确诊，超过34万人死于这种疾病，其5年生存率不足8%，素有“癌中之王”的称号。与其他恶性肿瘤相比较，PDAC是一种具有早期转移潜能的高侵... 展开 背景 胰腺癌（Pancreaticductaladenocarcinoma，PDAC)是世界范围内最难的恶性消化道肿瘤，每年有超过35万人被确诊，超过34万人死于这种疾病，其5年生存率不足8%，素有“癌中之王”的称号。与其他恶性肿瘤相比较，PDAC是一种具有早期转移潜能的高侵袭性肿瘤，并且对于放化疗以及靶向治疗均不敏感，手术治疗是其最有效的治疗手段。究其原因，除了与胰腺癌特殊的生物学行为有关外，还可能与其丰富的间质组成、高度乏氧乏血供的肿瘤微环境等密切相关。 肿瘤组织缺氧是PDAC的一个典型特征，与预后不良有关。多项基础研究发现，乏氧诱导因子HIF-1高表达可以促进癌细胞增殖、凋亡抵抗、上皮-间充质转化（EMT）、侵袭性和转移，以及对放化疗的抵抗性。我们实验室前期的多项研究也证实HIF-1高表达可以促进胰腺癌细胞增殖和凋亡抵抗，还能促进胰腺癌侵袭和迁移能力。因此，针对HIF-1功能的抑制剂在抗肿瘤的基础和临床前研究中得到广泛开展。本课题组多年来围绕胰腺癌的乏氧微环境做了深入研究，小分子CLT-003纳米颗粒化合物是我们的合作实验单位——美国奥克拉荷马州陈旦洋博士实验室合成的苯肽酰亚胺的类似物，经纳米技术包裹于聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒中形成的化合物。CLT-003可以显著抑制血管内皮细胞的增殖和HIF-1α的激活；此外，陈博士还发现CLT-003可以抑制胰腺癌细胞的活力。因此，鉴于CLT-003这两方面的作用，我们设想CLT-003能否通过抑制胰腺癌中HIF-1α的功能而发挥抗肿瘤的作用。基于此，我们设计和开展了本项课题研究。 方法 1.将4-硝基苯二甲酸酐在乙酸与2，6-二异丙基苯胺发生偶联反应，生成（2，6-二异丙苯基）-5-硝基-1-氢-异吲哚-1，3-二酮，该中间产物的硝基通过转移氢化反应被还原，生成纯度为99.2%的活性药物成分，也就是CLT-003化合物的活性药物成分。再利用专业的纳米技术将其包裹于聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒中形成的化合物。 2.选取胰腺癌、肺癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞系以及正常乳腺上皮细胞，利用CCK8实验检测CLT-003对于上述细胞系的细胞毒性，确定各细胞IC50值的范围；利用细胞周期实验和凋亡实验验证不同浓度梯度的CLT-003对于胰腺癌细胞的周期和凋亡的影响；应用细胞划痕实验证CLT-003对于细胞迁移运动的影响，transwell实验检测CLT-003对细胞侵袭能力的影响；最后应用平板克隆以及软琼脂克隆实验再次验证CLT-003对于胰腺癌细胞在二维平面和三维立体空间中增殖的影响。 3．建立胰腺癌SW1990细胞BABL/C裸鼠皮下移植瘤模型，以及PANC02细胞的胰腺癌原位移植瘤模型，静脉给与CLT-003低剂量（50mg/kg）和高剂量（100mg/kg）治疗，利用小动物活体成像技术，观察CLT-003对于胰腺癌肿瘤的生长的作用影响；同时应用免疫组化（immunohistochemistry，IHC）技术，在组织标本水平评价CLT-003对胰腺癌增殖和凋亡等蛋白的影响。 4.采用实时荧光定量PCR（realtimequantitypolymerasechainreaction，qPCR）技术、weternblot技术和免疫荧光技术等评价CLT-003对于HIF-1α的作用；qPCR技术、weternblot技术和ELISA实验检测CLT-003对于HIF-1下游靶基因表达的影响；双荧光素酶实验评价CLT-003对于HIF-1α转录活性的影响。 5.Weternblot技术检测CLT-003对于PI3K/AKT/mTOR信号通路的作用；蛋白降解实验和泛素化实验评价CLT-003对于HIF-1α稳定性的影响；蛋白核浆分离实验和免疫荧光技术评估CLT-003对于HIF-1α蛋白细胞入核的影响。 结果 1.小分子CLT-003纳米颗粒化合物，分子式是C20H22N2O2,分子量为322.4g/moL，其药物有效成分是苯肽酰亚胺的类似物，主要功能作用是用于治疗糖尿病视网膜病变的血管新生；此外，CLT-003可以抑制血管内皮细胞乏氧诱导因子HIF-1α的激活，降低血管内皮生长因子VEGF的表达水平。 2.CLT-003处理上述多种肿瘤细胞72h后，应用CCK8实验检测CLT-003对于上述各种细胞的IC50在2-8μM/L之间，而对乳腺正常上皮细胞MCF-10A的IC50为29.5±0.8μM/L，其细胞毒性明显减小；选用0、2.5、5和10μM/L四个浓度的CLT-003处理4种胰腺癌细胞18-24h，细胞周期进展出现明显的G2/M期阻滞，随着浓度增加，G2/M期细胞阻滞比例越高，具有统计学差异（P＜0.01）；同样，CLT-003处理胰腺癌细胞24h后，能够显著增加细胞的凋亡，且细胞凋亡比例随着CLT-003浓度增加而增高，具有统计学差异（P＜0.01）；通过平板克隆和软琼脂克隆实验发现CLT-003能够在二维平面和三维立体空间抑制肿瘤细胞增殖，并且各浓度组之间的差异具有统计学意义（P＜0.01）；此外，与空白组相比，CLT-003作用24-36h后，可以显著抑制胰腺细胞的平面移动能力和侵袭能力，各浓度间的差异同样具有统计学意义（P＜0.01）。 3.与生理盐水组相比，CLT-00350mg/kg和100mg/kg治疗组胰腺癌皮下移植瘤和胰腺原位移植瘤的生长明显受抑制，且抑制率在CLT-003100mg/kg时最显著，差异具有统计意义（P＜0.01），但生理盐水组和CLT-003低剂量和高剂量治疗组小鼠体重变化并未见显著差异。此外，CLT-003治疗还能延长胰腺原位移植瘤小鼠的生存期，组间的差异具有统计学意义（P＜0.01）。 4.CLT-003作用于胰腺癌CFPAC-1细胞24h和48h，能够明显抑制HIF-1α蛋白的表达水平，而且这种抑制作用具有时间和浓度依赖性，但是对于HIF-1α的mRNA无抑制作用；CLT-003在肺癌、乳腺癌、宫颈癌和结肠癌细胞中也能抑制HIF-1α蛋白的表达水平；此外，常氧和乏氧条件下，相对于细胞空白处理组，2.5、5和10μM/LCLT-003能降低HIF-1下游靶基因和GLUT1、TGF-α和VEGFmRNA和蛋白表达；最后，我们证实CLT-003能偶够抑制HIF-1α的转录活性。 5.常氧和乏氧条件下，相对于细胞空白处理组，2.5、5和10μM/LCLT-003作用于4种胰腺癌细胞6-12h，通过westernblot验证发现CLT-003能够明显抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活；而与空白组相比，CLT-003对于HIF-1α蛋白的降解速率和泛素化水平无明显影响；乏氧条件下，westernblot和免疫荧光验证结果显示CLT-003能够显著抑制HIF-1α蛋白的细胞入核过程。 结论 1.CLT-003纳米颗粒化合物是将苯肽酰亚胺的类似物经纳米技术包裹于聚乳酸羟基乙酸共聚物纳米颗粒中形成的小分子化合物。CLT-003主要作用是抑制糖尿病视网膜血管的新生，可能通过抑制血管内皮细胞乏氧诱导因子HIF-1α的激活以及血管生长因子VEGF的表达水平发挥作用； 2.CLT-003能够抑制多种肿瘤细胞的细胞活力，具有抗肿瘤普适性，但对于正常上皮细胞的细胞毒性较小；CLT-003具有诱导胰腺癌细胞G2/M期细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，抑制细胞增殖的作用；此外，CLT-003能够抑制胰腺癌细胞侵袭和迁移能力； 3.CLT-003在动物体内能够明显抑制胰腺癌肿瘤的生长，并延长生存期，且无明显毒副作用； 4.CLT-003能够抑制胰腺癌组织和细胞中的HIF-1α蛋白表达，降低HIF-1α的转录活性，进而抑制HIF-1α下游靶基因GLUT1、TGF-α和VEGF的表达； 5.CLT-003能够抑制胰腺癌细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的激活，进而减少HIF-1α蛋白的翻译合成；CLT-003还能够抑制HIF-1α蛋白入核过程，从而进一步减弱HIF-1的转录功能。 收起