摘要: 研究目的： 探究甲基化CpG结合域蛋白2（Methyl-CpG binding domain protein2, MBD2）在人胰腺癌细胞株中的表达，以及其对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并探究其作用的可能分子机制。 研究方法： 1.采取荧光定量PCR和Western blot检测... 展开 研究目的： 探究甲基化CpG结合域蛋白2（Methyl-CpG binding domain protein2, MBD2）在人胰腺癌细胞株中的表达，以及其对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响，并探究其作用的可能分子机制。 研究方法： 1.采取荧光定量PCR和Western blot检测MBD2在三种人胰腺细胞株中的表达。 2.根据MBD2 shRNA的序列，构建MBD2 shRNA干扰质粒pLKO.1-sh-MBD2(MBD2 shRNA)，并在mRNA和蛋白水平鉴定其干扰效果；将MBD2的CDS区序列克隆至真核表达载体p3xFLAG-CMV-24，构建MBD2的过表达质粒3xFlag-MBD2，并在mRNA和蛋白水平鉴定MBD2过表达效果。 3.将干扰质粒MBD2 shRNA转入高表达MBD2的胰腺癌细胞株PaTu8988和SW1990，将过表达载体3xFlag-MBD2转入低表达MBD2的BxPC3细胞，采用CCK8法、克隆形成实验、Transwell迁移和侵袭实验检测MBD2对胰腺癌细胞株增殖、迁移和侵袭的影响。 4.将干扰质粒MBD2 shRNA转入高表达MBD2的胰腺癌细胞株PaTu8988和SW1990，将过表达载体3xFlag-MBD2转入低表达MBD2的BxPC3细胞，Western blot检测EMT主要指标蛋白、转移相关蛋白MMP2和MMP9的变化及Hippo信号通路相关蛋白水平的变化。 研究结果： 1.MBD2差异性表达于3种胰腺癌细胞株，在PaTu8988细胞中表达相对最高， SW1990细胞次之，而BxPC3细胞中MBD2的表达水平相对最低。 2．菌液PCR、重组质粒双酶切及上海生工测序鉴定结果表明， MBD2 shRNA和3xFlag-MBD2质粒构建成功。 3．本实验所构建的MBD2 shRNA质粒能够有效地抑制胰腺癌PaTu8988和SW1990细胞中MBD2的表达；本实验所构建的3xFlag-MBD2质粒能够高效地在BxPC3细胞中过表达MBD2。 4.与对照组对比，下调MBD2的表达后，PaTu8988和SW1990细胞的增殖率、克隆形成率、迁移率及侵袭率均减少。相反，上调MBD2的表达后，BxPC3细胞增殖率、克隆形成率、迁移率及侵袭率均增加。 5.下调MBD2的表达后，PaTu8988和SW1990细胞的EMT能力减弱，MMP2和MMP9的蛋白表达水平降低，Hippo信号通路中Mst1、Mst2、p-Mob1、p-Lats1、p-Yap蛋白表达量明显升高，Yap蛋白表达量明显降低；相反，上调MBD2的表达后，BxPC3细胞的EMT能力增强，MMP2和MMP9的蛋白表达水平增加，Hippo信号通路中Mst1、Mst2、p-Mob1、p-Lats1、p-Yap蛋白表达量明显降低，Yap蛋白表达量明显升高。 研究结论： MBD2可能通过调控Hippo信号通路促进胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭等生物学功能，具体作用机制需要更深入的研究阐明。 收起