摘要: 目的:(1)评价纳米银（silver nanoparticles，AgNPs）溶液冲洗对牙本质粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)生物膜的抗菌效果;(2)评价AgNPs凝胶封药对牙本质E.faecalis生物膜的抗菌效果;(3)评价AgNPs凝胶处理的牙本质抵抗E.faecalis的附着和... 展开 目的:(1)评价纳米银（silver nanoparticles，AgNPs）溶液冲洗对牙本质粪肠球菌(Enterococcus faecalis，E.faecalis)生物膜的抗菌效果;(2)评价AgNPs凝胶封药对牙本质E.faecalis生物膜的抗菌效果;(3)评价AgNPs凝胶处理的牙本质抵抗E.faecalis的附着和生物膜形成的能力;(4)制备并表征介孔生物活性玻璃(mesoporous bioactive glasses，MB Gs)和载银介孔生物活性玻璃(Ag-loaded mesoporous bioactive glasses，Ag-MBGs)，初步评价Ag-MBGs对根管E.faecalis生物膜的抗菌效果。 方法:实验一:在牙本质片上构建4周E.faecalis生物膜，然后将96个牙本质片随机均分为4组(n=24)，分别以0.1％AgNPs溶液、2％次氯酸钠(sodium hypochlorite，NaOCl)溶液和生理盐水为冲洗液，使用注射器针头冲洗牙本质E.aecalis生物膜2分钟，未处理标本作为对照组。利用扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)观察每组12个标本E.faecalis生物膜的结构，每组另外12个标本用激光共聚焦扫描显微镜(confocal laser scanning microscopy,CLSM)结合LIVE/DEAD荧光染色法分析E.faecalis生物膜内活菌比，评价0.1％AgNPs溶液冲洗对牙本质E.faecalis生物膜的抗菌效果。实验二:在牙本质片上和牙根锥块内构建4周E.faecalis生物膜，然后将80个牙本质片和40个牙根锥块随机均分为4组（每组20个牙本质片和10个牙根锥块），分别用0.02％AgNPs凝胶、0.01％AgNPs凝胶、氢氧化钙(calcium hydroxide，Ca(OH)2)糊剂和生理盐水封药7天。SEM观察每组10个牙本质片上E.faecalis生物膜的结构，CLSM结合LIVE/DEAD荧光染色法分析每组另外10牙本质片上残留E.faecalis生物膜内活菌比。获取牙根锥块内0～100μm和100～200μn深度的牙本质碎屑，分散、梯度稀释后涂布BHI琼脂培养板，培养24小时后计数菌落形成单位(colony forming units,CFUs)，评价药物对牙本质小管内E.faecalis的抗菌效果。实验三:将200个牙本质片平均分为5组:生理盐水组、Ca(OH)2糊剂组、2％洗必泰(Chlorhexidine，CHX)凝胶组、0.01％和0.02％AgNPs凝胶组。标本经上述药物处理7天后接种E.faecalis悬液，37℃厌氧培养1天或7天。SEM定性评价E.faecalis对牙本质的附着和生物膜形成情况，CLSM结合LIVE/DEAD荧光染色法定量分析牙本质表面附着的E.faecalis总量和活菌比。制备牙本质片20个，分别用0.01％和0.02％AgNPs凝胶封药7天。将牙本质片放入无菌24孔板中，每孔加入1mLddH2O。1天和7天时，分别吸取每组5个孔内的液体，电感耦合等离子原子发射光谱仪测量液体中Ag+浓度。实验四:采用溶剂挥发诱导自组装结合凝胶-溶胶技术合成MBGs，采用离子吸附法制备Ag-MBGs，表征MBGs和Ag-MBGs的理化性能，评价MBGs和Ag-MBGs在Tris-HCl缓冲液中的离子释放特征，以及浸入模拟体液(simulated body fluids，SBF)后的pH值变化情况。在12个根管预备后的单根下颌前磨牙根管内构建4周E.faecalis生物膜，分别用Ca(OH)2糊剂、MBGs和Ag-MBGs封药7天。利用SEM、CLSM结合LIVE/DEAD荧光染色法观察药物处理后根管内的E.faecalis生物膜结构，初步评价Ag-MBGs对根管E.faecalis生物膜的抗菌效果。 结果:实验一:经2％NaOCl溶液冲洗的牙本质E.faecalis生物膜结构明显破坏，仅少量的生物膜残留在牙本质表面;0.1％AgNPs溶液冲洗并不能破坏牙本质E.faecalis生物膜结构完整性，生物膜内活菌比低于未处理组(P＜0.05)，但与生理盐水冲洗组无统计学差异(P＞0.05)。实验二:AgNPs凝胶显著破坏牙本质E.faecalis生物膜的结构并杀灭生物膜内细菌。其中0.02％AgNPs凝胶组牙本质E.faecalis生物膜内活菌比、牙本质小管内0～100μm和100～200μm深度的CFUs少于0.01％AgNPs组和Ca(OH)2组(P＜0.05)，后两组又显著少于生理盐水组(P＜0.05)。实验三:生理盐水和Ca(OH)2处理的牙本质表面聚集大量E.faecalis，随着培养时间延长逐渐形成稠密的E.faecalis生物膜;AgNPs凝胶处理的牙本质表面附着的细菌较少，形成的E.faecalis生物膜稀疏;而2％CHX处理的牙本质表面附着的细菌最少。2％CHX组平均细菌总量和活菌比显著低于AgNPs凝胶组(P＜0.05)，后者又显著低于生理盐水组和Ca(OH)2组(P＜0.05);培养1或7天，0.01％和0.02％AgNPs凝胶组的平均细菌总量和活菌比均无明显差异(P＞0.05)。AgNPs凝胶处理后的牙本质浸泡在ddH2O中1天或7天，0.02％AgNPs凝胶组牙本质释放的Ag+量均高于0.01％AgNPs凝胶组(P＜0.05)。0.02％或0.01％AgNPs凝胶组牙本质浸泡在ddH2O中7天释放的Ag+量高于1天，但差异无统计学意义(P＞0.05)。实验四:合成的MBGs为典型的介孔材料:表面光滑均匀平整，内部有规则的介孔通道，Ⅵ型氮气吸附-脱附等温线和H1型滞后环，平均孔径为4.7nm，对应的XRD小衍射角出现三个衍射峰。Ag-MBGs内部保持介孔结构，但介孔通道边缘变得不规整，表面和内部有大量纳米颗粒，EDS能谱证实为Ag元素。MBGs和Ag-MBGs浸泡在SBF中，SBF的pH值轻度上升，并保持稳定;在Tris-HCl中各元素呈缓释状态，释放速率随时间延长而降低。经Ag-MBGs处理的根管E.faecalis生物膜结构破坏明显，仅残留少量细菌在牙本质小管口内;而经MBGs处理的E.faecalis生物膜结构完整，残留大量活菌。有少量Ag-MBGs和MBGs颗粒残留在根管壁上。 结论:1.AgNPs对牙本质E.faecalis生物膜的抗菌效果与其应用方式有关。AgNPs溶液冲洗不能破坏牙本质表面E.faecalis生物膜结构，但AgNPs凝胶封药能破坏牙本质表面的E.faecalis生物膜结构，并有效杀灭牙本质表面和牙本质小管内的E.faecalis。2.2％CHX处理的牙本质能产生明显的持续抗菌效果。AgNPs凝胶处理的牙本质浸泡在液体中迅速释放Ag+，不能形成缓释;AgNPs凝胶处理的牙本质与E.faecalis接触早期可导致E.faecalis死亡，但7天后出现E.faecalis对牙本质的附着和生物膜的形成。Ca(OH)2处理的牙本质无持续抗菌效果。3.Ag-MBGs形成Ag缓释系统，对根管内E.faecalis生物膜具有较强的抗菌效果，抗菌效果与其释放的Ag+有关。 收起