摘要: 结直肠癌是西方国家癌症死亡的第二大常见原因，亚太地区结直肠癌的发病率正逐年上升。原发肿瘤的有效切除和辅助化疗可改善了患者的生存率，但近半数患者最终死于局部复发和转移。目前，靶向治疗已成为各种恶性肿瘤（包括结直肠癌）的重要治疗手段。... 展开 结直肠癌是西方国家癌症死亡的第二大常见原因，亚太地区结直肠癌的发病率正逐年上升。原发肿瘤的有效切除和辅助化疗可改善了患者的生存率，但近半数患者最终死于局部复发和转移。目前，靶向治疗已成为各种恶性肿瘤（包括结直肠癌）的重要治疗手段。贝伐单抗（靶向血管内皮生长因子VEGF）和西妥昔单抗（靶向表皮生长因子受体EGFR）是批准用于治疗进行性和或转移性结肠直肠癌的两种靶向药物。但是分子靶向治疗也存在多靶点联合治疗的问题。所以需要寻找新的有效的治疗结直肠癌的靶点。 成纤维生长因子受体(FGFRs)是一种细胞膜蛋白，属免疫球蛋白基因超家族成员，FGFR家族成员有FGFR1、FGFR2、FGFR3以及FGFR4。FGFR4是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体中的一种，在胚胎发育、组织修复和血管形成等进程中起着十分重要的作用。但FGFR4在恶性肿瘤中的研究相对较少。 FGFR4在常见的恶性肿瘤如胃癌、胰腺癌、乳腺癌以及肾细胞癌中均高表达。我们以前的研究结果显示，敲低FGFR4表达抑制胃癌细胞的增殖并促进细胞凋亡。FGFR抑制剂PD173074和5-Fu联合作用于胃癌细胞，可明显增加细胞的凋亡率。Blu9931是首个FGFR4高效选择性抑制剂，报道显示它能够抑制肝癌细胞增殖，但在结赢肠癌中还未有相关报道。 上皮-间质转化(EMT)被认为是肿瘤转移中的关键事件，并在结直肠癌的进展中起重要作用。在EMT过程中，细胞失去了上皮细胞表型(如E-Cadherin)而获得间质细胞表型（如Vimentin）。在肝癌细胞中，FGF19通过促进FGFR4表达而促进了EMT进程。但是在结直肠癌中FGFR4对EMT的作用尚不十分清楚。 由于目前FGFR4在结直肠癌中的研究相对较少，因此本课题重点研究FGFR4在结直肠癌发生发展及转移的作用。为结直肠癌预后、诊断和治疗提供有力的理论依据。 本课题通过免疫组化检测FGFR4在正常人类结直肠组织和结直肠癌组织中的表达情况，并进行预后分析。通过慢病毒构建FGFR4沉默细胞株进行一系列体外功能试验，检测FGFR4沉默对结直肠癌肿瘤细胞在增殖、侵袭、凋亡、周期和上皮间质转化(EMT)的作用。探讨FGFR4抑制剂Blu9931单药或联合5-Fu对结直肠癌生物学特性的影响及分子机制，为Blu9931应用于结直肠癌临床治疗提供依据。 第一部分 成纤维生长因子受体4在结直肠癌中的功能作用 目的: 结直肠癌是全世界最常见的消化道肿瘤之一，是西方国家癌症死亡的第二大常见原因，而我国结直肠癌的发病率也在增加。原发肿瘤的有效切除和辅助化疗可改善了患者的生存率，而肿瘤的复发与转移严重影响患者生存期。目前，靶向治疗已成为各种恶性肿瘤（包括结直肠癌）的重要治疗手段。靶向药物的出现为结直肠癌患者带来了新的希望，且出现了令人欣喜的临床疗效。FGFRs是一种细胞膜蛋白，属免疫球蛋白基因超家族成员。FGFR家族成员有FGFR1、FGFR2、FGFR3以及FGFR4。FGFR4是一类具有自身磷酸化活性的跨膜酪氨酸激酶受体中的一种，在胚胎发育、组织修复和血管形成等过程中起着十分重要的作用。有研究证明FGFR4在多种恶性肿瘤中高表达，且我们以前试验表明FGFR4沉默可以抑制胃癌细胞生长和促进凋亡。但是FGFR4在结直肠中的研究相对较少。本研究旨在通过免疫组化检测FGFR4在人结直肠癌组织中的表达情况及临床意义。通过慢病毒转染使结直肠癌细胞FGFR4沉默，探讨FGFR4蛋白如何影响结直肠癌细胞生物学特性及作用机制。 方法: 本研究通过购买人结直肠癌组织芯片，其中包括100例结直肠癌组织和60例癌旁组织。免疫组化法检测FGFR4在结直肠癌及正常组织中的表达情况，并进行预后分析。慢病毒转染SW620结直肠癌细胞株以沉默FGFR4的表达，通过免疫荧光及western blot法验证干扰效率，然后进行一系列体外功能实验，包括增殖实验、侵袭实验、划痕实验、流式细胞仪检测不同处理因素作用后的凋亡率以及细胞周期分布情况。通过western blot检测FGFR4沉默对凋亡、细胞周期和上皮间质转化相关蛋白的表达情况。且通过加入β-catenin抑制剂XAV-939来探讨FGFR4对EMT的影响是否通过Wnt/β-catenin通路。 结果: 与正常组织相比，FGFR4在结直肠癌组织中过表达。FGFR4表达阳性的患者5年生存率低于FGFR4表达阴性的患者(64％vs74％)。FGFR4沉默抑制结直肠癌细胞SW620的增殖和侵袭，阻滞细胞周期于S期，促进细胞凋亡。FGFR4沉默逆转了上皮间质转化进程，且在XAV939（β-catenin抑制剂）存在的情况下，FGFR4沉默进一步逆转了EMT进展。 结论: 我们的数据表明FGFR4可能与结赢肠癌患者的预后相关。体外功能检测显示FGFR4是结直肠癌的有效治疗靶点。FGFR4可能通过Wnt/β-catenin途径影响EMT过程。 第二部分 FGFR4特异性抑制剂Blu9931联合5-Fu对结直肠癌细胞株作用机制研究 目的: 本课题上一部分研究结果提示FGFR4可能成为一个新的治疗靶点。Blu9931是首个FGFR4高效选择性抑制剂，报道显示它能够抑制肝癌细胞增殖，但在结直肠癌中还未有相关报道。本部分的研究目的是通过5-Fu和Blu9931单药或联合用药处理FGFR4高表达的结直肠癌细胞株，以探讨FGFR4抑制剂Blu9931单药或联合5-Fu对结直肠癌生物学特性的影响及分子机制，为结直肠癌治疗提供新的靶向药物。 方法: 使用PCR和蛋白印迹技术检测常见的5种常见的结直肠癌细胞系FGFR4的表达情况。选取两株FGFR4高表达的结直肠癌细胞系进行后续实验。Blu9931、5-Fu单药或联合用药作用于HCT116和SW620结直肠癌细胞株，然后进行细胞存活实验、增殖实验、流式细胞仪检测不同处理因素作用后的凋亡率以及细胞周期分布情况，western blot法检测在不同处理条件下凋亡及细胞周期相关蛋白的表达变化。Western blot法检测在不同处理条件下EMT相关蛋白的表达情况。 结果: Western blot结果显示，相对于LS47，DLD1和SW116这三株细胞，FGFR4在HCT116和SW620这两株结直肠癌细胞系中表达最强。反转录PCR结果显示，FGFR4mRNA在HCT116和SW620中的表达量明显高于其它三株细胞。实时荧光定量PCR的结果与上诉一致(P＜0.05)。随着5-Fu和Blu9931浓度增加，HCT116和SW620细胞活力逐渐下降。MTT实验测量肿瘤细胞加药后吸光度的变化，通过计算得到两株细胞在不同药物作用下的IC50。增殖实验显示，在加药后的2-5天，5-Fu和Blu9931单独或联合作用于肿瘤细胞的吸光度值明显低于对照组(P＜0.05)。且5-Fu和Blu9931联合使用比单独使用对细胞的抑制作用更加明显(P＜0.05)。细胞凋亡结果显示，在HCT116细胞中，与对照组比较，5-Fu和Blu9931单独作用于细胞可明显增加细胞凋亡率，而联合使用更进一步促进凋亡(P＜0.05);在SW620细胞中，与对照组比较，5-Fu和Blu9931单独或联合作用于细胞可明显增加细胞凋亡率，但三组之间没有差异;5-Fu和Blu9931单独或联合作用予两株细胞都可明显促进cleaved-caspase3的表达，只有5-Fu组促进了Stat3的表达。 结论: Blu9931通过特异性地抑制FGFR4活性来抑制结直肠癌细胞的增殖、促进细胞凋亡，阻滞细胞周期和逆转EMT进程。Blu9931和5-Fu在抑制肿瘤细胞增殖和阻滞细胞周期方面有协同作用。以上结果表明，Blu9931作为FGFR4第一个特异性抑制剂可以成为治疗结直肠癌新的靶向药物。 全文结论: 免疫组化法检测FGFR4在人结直肠癌及正常组织中的表达情况发现，FGFR4在结直肠癌组织中高表达，且FGFR4阳性表达患者5年生存率较低，但是FGFR4不是结直肠癌患者的独立预后因素。通过转染慢病毒构建FGFR4沉默结直肠细胞株，并进行一系列体外功能实验。FGFR4沉默可通过促进细胞凋亡和阻滞细胞周期来抑制结直肠癌细胞增殖。FGFR4沉默可能通过逆转EMT进程来抑制结直肠癌细胞侵袭与浸润。而FGFR4对EMT进程的影响可能通过Wnt/β-catenin通路发挥作用。结果表明FGFR4可能是结直肠癌潜在的治疗靶点。FGFR4特异性抑制剂Blu9931可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，阻滞细胞周期和逆转EMT进程。Blu9931和5-Fu在抑制肿瘤细胞增殖和阻滞细胞周期方面有协同作用。结果表明Blu9931可以成为治疗结直肠癌的靶向药物。但，Blu9931和5-Fu的联合治疗价值还需要进一步验证，为临床提供治疗依据。 收起