摘要: 目的： 原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma, POAG）是指由于病理性高眼压引起特征性视盘损害和视野缺损，而且眼压升高时前房角开放的一种青光眼。目前，其发病机制尚未完全阐明。其中，小梁网细胞细胞外基质异常积聚是造成房水流出... 展开 目的： 原发性开角型青光眼（primary open angle glaucoma, POAG）是指由于病理性高眼压引起特征性视盘损害和视野缺损，而且眼压升高时前房角开放的一种青光眼。目前，其发病机制尚未完全阐明。其中，小梁网细胞细胞外基质异常积聚是造成房水流出受阻、眼压升高的关键因素。因此，寻求解决小梁网细胞细胞外基质异常沉积这一科学问题的途径成为我们关注的焦点。组蛋白和非组蛋白去乙酰化酶SIRT1(sirtuin1)在其他疾病研究中有抗纤维化、抗氧化等作用，另外SIRT1激动剂白藜芦醇具有降低眼压的作用。我们推测SIRT1在人小梁网细胞中可能发挥抑制细胞外基质异常沉积的作用。另外，有研究显示，SIRT1与转录因子HES1(hes family bHLH transcription factor1)蛋白之间有相互作用，并且HES1可能直接参与COL1A1(collagen type1α1)的转录调控。故本课题希望在人小梁网细胞中证实SIRT1-HES1-COL1A1途径的存在，以阐明SIRT1作为青光眼治疗靶点的作用机制。 方法： 利用免疫荧光技术探索SIRT1在人小梁网细胞中的表达及定位。利用SIRT1激动剂白藜芦醇不同浓度（0，10，25，50μM）分别处理人小梁网细胞12 h。利用Western Blot及qPCR分别检测白藜芦醇对SIRT1转录和蛋白水平的影响，并同时分析白藜芦醇对细胞外基质COL1A1表达的影响。利用病毒感染的方法，在人小梁网细胞中实现SIRT1的敲低或者过表达，Western Blot及qPCR检测SIRT1敲低及过表达的效果，同时检测SIRT1敲低及过表达对COL1A1表达的影响。 利用病毒感染的方法，在人小梁网细胞中敲低HES1，Western Blot及qPCR检测HES1敲低效率，并同时检测HES1对COL1A1的正向调控作用。利用SIRT1激动剂白藜芦醇不同浓度（0,10,25,50μM）分别处理人小梁网细胞，作用时间12h。利用Western Blot及qPCR分别检测白藜芦醇激动SIRT1后对HES1表达的影响。通过病毒感染，在人小梁网细胞中实现SIRT1的敲低或者过表达，Western Blot及 qPCR检测 SIRT1敲低及过表达对 HES1表达的影响。ChIP实验及 DNA pull-down实验分别检测SIRT1敲低后HES1与COL1A1启动子区域结合的情况。最后，利用300μM过氧化氢刺激人小梁网细胞2h，建立氧化应激模型。在氧化应激状态下，Western Blot检测SIRT1激动剂白藜芦醇及过表达SIRT1对COL1A1的调控作用。 结果： 免疫荧光结果显示，SIRT1在人小梁网细胞中表达，并且只分布在人小梁网细胞的细胞核中。SIRT1激动剂白藜芦醇在人小梁网细胞中激活SIRT1的蛋白表达，并且可以抑制细胞外基质成分 COL1A1的合成。在人小梁网细胞中敲低SIRT1，COL1A1表达上调，而过表达SIRT1，COL1A1表达下调。 在人小梁网细胞中抑制HES1蛋白能降低COL1A1的表达，即验证了HES1对COL1A1的正向调控作用。过表达SIRT1可以下调HES1的表达，抑制SIRT1可上调HES1的表达，另外，ChIP实验及DNA pull-down实验结果显示，抑制SIRT1后，HES1在COL1A1的启动子区域结合位点富集量增加。在氧化应激状态下，SIRT1表达水平下调，COL1A1及HES1表达水平上调。另外，在氧化应激状态下，抑制HES1可以下调COL1A1的表达，过表达SIRT1及利用SIRT1的激动剂白藜芦醇可下调HES1及COL1A1的表达。 结论： 1.SIRT1可以负向调控COL1A1合成；HES1可以正向调控COL1A1合成。 2.抑制SIRT1可以上调HES1与COL1A1启动子区域的结合。 3.氧化应激状态下，SIRT1可以依赖HES1从而调控COL1A1的表达。白藜芦醇通过激活SIRT1下调HES1及COL1A1的表达，从而可能达到降眼压的效果。 收起