摘要: 背景：青光眼足一组以进行性视神经萎缩为特征的不可逆性致盲眼病的总称，原发性开角型青光眼(POAG)是其中最常见的类型之一，发病机制至今尚未阐明。目前普遍认为，异常升高的眼内压是POAG发生和进展的主要危险因素。眼内压的大小由房水产生和流出量... 展开 背景：青光眼足一组以进行性视神经萎缩为特征的不可逆性致盲眼病的总称，原发性开角型青光眼(POAG)是其中最常见的类型之一，发病机制至今尚未阐明。目前普遍认为，异常升高的眼内压是POAG发生和进展的主要危险因素。眼内压的大小由房水产生和流出量的相对比例决定。作为房水外流通路的主要部位，小梁网在眼内压的调控过程中起着重要作用，培养的小梁网细胞也成为青光眼研究领域必不可少的体外模型。 细胞内基因表达受多种因素的影响，并产生不同的蛋白质组成以适应微环境的变化，只有对这种蛋白质组的特有组成及其改变的研究，即差异蛋白质组研究，才能认识生命活动的本质。因而，鉴别POAG病人小梁网细胞蛋白差异表达对于理解其发病机制很有必要。蛋白质组学作为筛选差异蛋白的有力工具，已经被应用于POAG发病机制的研究，但这些有限的小梁网蛋白质组学研究均集中在可溶性蛋白质的表达上，小梁网细胞膜蛋白质组学的研究还未见报道。膜蛋白平衡于细胞和胞外环境的界面，执行着重要的生理功能，如细胞间的识别、离子和溶质的转运以及作为多种信号的受体等；近年来发现膜蛋白还具有重要的药理作用，仅占人类基因组编码蛋白1／3的膜蛋白，所拥有的药物靶点却超过2／3以上。应用大规模，高通量的方法进行膜蛋白研究，对于理解膜蛋白在基本的病理生理过程和药物研发非常必要。 本研究对比了正常人和POAG病人小梁网细胞膜蛋白的表达模式。发现两种细胞膜蛋白表达模式整体上相似，均具有较高的可重复性和分辨率，并重点研究了其中一个在POAG病人小梁细胞膜中表达增高的蛋白，copinel。然后通过细胞分布研究证实，copinel在POAG病人小梁细胞膜和浆中均有表达，而且细胞外钙离子内流可明显促进copinel的膜转运。我们首次报道了copinel在小梁网细胞中的表达，并证实了copinel在POAG小梁网细胞膜中的表达增高与其钙离子依赖的膜转运特性有关。 方法：对象为稳定转化和原代培养的正常人与POAG病人的小梁网细胞。提取细胞膜蛋白进行双向凝胶电泳分析后，应用质谱分析并联合数据库检索进行蛋白质的识别；应用适时定量real-time PCR和蛋白质印迹法对其中的一个膜差异表达蛋白copinel，分别在基因和蛋白水平进行验证；荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞内钙离子浓度，所用钙离子荧光探针为Fluo 3-AM；应用钙离子运载剂A23187，增加细胞内钙离子浓度；应用蛋白质印迹法检测copinel在小梁网细胞内钙离子浓度增加前后的表达和分布。 结果：双向电泳结果显示copinel在POAG病人小梁网细胞膜高表达，但正常人小梁网细胞膜无表达；荧光显微镜下观察POAG病人小梁网细胞较正常人小梁网细胞有更高的Fluo 3-AM荧光强度，流式细胞仪定量结果显示，POAG病人小梁网细胞内钙离子浓度高于正常对照组细胞；细胞分布研究显示，在POAG病人小梁网细胞的膜和浆中均有copinel的表达，但正常人小梁网细胞仅在浆中有该蛋白的表达；通过应用钙离子运载剂增加细胞内钙离子浓度后，POAG病人小梁网细胞浆中的copinel全部转移到了胞膜上，但在正常人小梁网细胞中仅有一小部分蛋白发生了转运。 结论：Copinel在POAG病人小梁网细胞膜中表达增高，可能与POAG病人小梁网细胞内钙离子浓度增高所引起该蛋白的膜转运有关。copinel在小梁网细胞中的功能研究将会增加对POAG病理学机制的理解，可能有助于开发新的靶点作用药物。 收起