摘要: 肝细胞癌是一种严重威胁人类生命健康的重要疾病，也是在世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的高转移率以及术后高复发率使得传统的治疗和预后效果越来越局限。血管生成是影响肿瘤转移的重要因素之一。新生血管为肿瘤组织不断的输送营养物质以及排... 展开 肝细胞癌是一种严重威胁人类生命健康的重要疾病，也是在世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。肝癌的高转移率以及术后高复发率使得传统的治疗和预后效果越来越局限。血管生成是影响肿瘤转移的重要因素之一。新生血管为肿瘤组织不断的输送营养物质以及排泄代谢产物，同时也为肿瘤的侵袭和转移提供良好的通道。研究报道显示多种信号分子参与血管生成，其中VEGFA以及MMP9是最重要的促血管生成因子。 DEC1是一个胚胎软骨发育基因，也是碱性螺旋-环-螺旋结构类转录调节因子，在对软骨形成、脂质代谢、细胞分化衰老、肿瘤的发生中起着重要的作用。近年来研究发现DEC1在多种肿瘤中呈现组织特异性的表达模式，而且发现它还是一个与肿瘤的发生发展有关的转录因子，在肿瘤细胞的增殖、分化中起着重要的作用。血管生成是肿瘤复发和转移的重要因素，并且可能是目前和未来肿瘤治疗的重要靶点，因此探讨DEC1对肿瘤血管生成的作用有着重要的现实意义，目前尚未有研究报道。 第一部分 过表达/敲除DEC1对内皮细胞增殖、迁移及血管形成的影响 目的:探讨过表达/敲除DEC1对内皮细胞增殖、迁移及血管形成的影响 方法:(1)过表达DEC1细胞系的建立:采用脂质体瞬时转染入内皮细胞得到空质粒组Flag-CMV2，过表达DEC1组Flag-DEC1;敲除DEC1细胞系的建立:将包装好的慢病毒感染内皮细胞系，通过嘌呤霉素抗性筛选得到表达shDEC1的稳转细胞株用于后续实验，得到空病毒组shRNA，敲除DEC1组shDEC1。(2)采用MTT法检测比较DEC1基因对内皮细胞增殖能力的影响。(3)运用Transwell小室实验、划痕实验比较DEC1的表达对内皮细胞迁移能力的影响。(4)使用小管形成实验检测DEC1的表达对内皮细胞成管能力的影响(5)通过Real-time PCR和Western blot检测基因在mRNA和蛋白水平上的表达。 结果:(1)瞬时转染DEC1的内皮细胞与空质粒的对照组相比，DEC1的表达显著增高;慢病毒感染内皮细胞经过嘌呤霉素筛选30天后，空病毒对照组与稳定表达shDEC1的细胞生长状态均良好，且蛋白水平检测敲除效率明显。(2) DEC1过表达/敲除对内皮细胞HUVEC增殖、迁移以及成管能力的影响:a，增殖能力:相对于空质粒对照组Flag-CMV2，过表达组Flag-DEC1的内皮细胞生长速度下降;与空病毒组shRNA相比，敲除组shDEC1的内皮细胞生长速度加快，细胞OD值增加明显;b，迁移能力:和对照组Flag-CMV2相比，Flag-DEC1组的细胞在划痕实验中，细胞向中心迁移的距离变小，在小室穿膜实验中，醋酸洗脱的细胞OD值降低，穿膜数目减少;而相对于shRNA，shDEC1组细胞向划痕中心迁移距离增大，几乎覆盖整个中心区域，细胞OD值升高，穿膜细胞数增加。c，成管能力:与对照组Flag-CMV2相比，Flag-DEC1组的内皮细胞小管长度缩短了48.28％，相对于shRNA，shDEC1细胞小管长度增加了84.19％(3)过表达DEC1的内皮细胞其mRNA结果显示促血管生成因子VEGFA，bFGF，MMP9均显著降低，蛋白水平上VEGFA，MMP9的表达也明显减少;敲除DEC1的内皮细胞，mRNA结果显示促血管生成因子VEGFA，Angiogenin，MMP9均显著升高，蛋白水平上VEGFA，MMP9的表达也明显增加。(4) DEC1过表达对内皮细胞EAhy926增殖、迁移以及成管能力的影响:相对于空质粒对照组，过表达组Flag-DEC1的内皮细胞生长速度下降，细胞增殖能力降低;划痕实验中，细胞向中心迁移的距离变小，在小室穿膜实验中，醋酸洗脱液细胞OD值降低，穿膜数目减少，内皮细胞迁移能力降低;与对照组相比，Flag-DEC1组的内皮细胞小管长度缩短了57.22％，成管能力降低，Real-time PCR结果显示促血管生成因子VEGFA，bFGF，MMP9均显著降低，蛋白水平上VEGFA，MMP9的表达也明显减少。 结论:(1)过表达DEC1基因能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及血管形成;敲除DEC1基因能促进人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移及血管形成，初步探究DEC1可能是通过影响血管生成因子的表达，调节内皮细胞血管生成。(2)过表达DEC1抑制内皮细胞EAhy926增殖、迁移以及血管生成，且可能与血管生长因子VEGFA、MMP9表达降低有关 第二部分 肝肿瘤细胞DEC1影响内皮细胞体外血管形成 目的:探讨肝肿瘤细胞DEC1对内皮细胞体外血管形成的影响 方法:(1)使用敲除和过表达DEC1的肝癌细胞株，收集细胞培养上清液处理HUVEC内皮细胞(2)运用Transwell小室实验比较HUVEC内皮细胞迁移能力。(3)使用小管形成实验检测HUVEC内皮细胞成管能力。(4)通过Real-time PCR和Western blot检测目标基因在mRNA和蛋白水平上的影响。 结果:(1)和对照组相比，敲除DEC1的肝癌细胞诱导HUVEC内皮细胞迁移能力增强，细胞穿过小室的数量增加，形成小管的长度增加了76.46％;而使用过表达DEC1的肝癌细胞培养上清液处理HUVEC内皮细胞，发现其迁移能力降低，穿膜细胞数减少，成管能力明显降低，成管长度缩短了52.48％。(2)敲除DEC1的肝癌细胞，促血管生长因子VEGFA、Angiogennin、MMP9在mRNA水平上显著增加，VEGFA、MMP9在蛋白水平上也明显增加;过表达DEC1的肝癌细胞株中，VEGFA、bFGF、MMP9明显降低，蛋白水平上MMP9、VEGFA表达减少。 结论:肝肿瘤细胞DEC1抑制内皮细胞体外血管生成，可能与下调VEGFA、MMP9的表达有关。 收起