摘要: 目的: 既往认为转录因子SOX5主要参与胚胎发育、细胞周期及软骨形成的调控，而在类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)中的作用尚未见报道。我们前期在RANKL基因启动子区发现一个RA新的易感位点，该位点突变后形成转录因子SOX5结合位点。随后，... 展开 目的: 既往认为转录因子SOX5主要参与胚胎发育、细胞周期及软骨形成的调控，而在类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)中的作用尚未见报道。我们前期在RANKL基因启动子区发现一个RA新的易感位点，该位点突变后形成转录因子SOX5结合位点。随后，我们原创性发现SOX5在RA滑膜组织中高表达，能调控滑膜成纤维细胞(Synovial Fibroblasts，SFs)中RANKL高表达，参与RA骨侵蚀。类似于肿瘤细胞的迁移与侵袭性是RA SFs的重要特征，本研究主要探讨SOX5对RA SFs迁移和侵袭特性的影响及其可能的机制。 方法: 1.转录因子SOX5对RA SFs迁移及侵袭能力的影响 (1)构建低表达SOX5慢病毒载体转染成纤维细胞，沉默RA SFs中SOX5的表达，采用Transwell小室迁移实验、划痕试验、Transwell小室加基质胶侵袭实验检测沉默SOX5后对RA SFs迁移及侵袭的影响; (2)鬼笔环肽染色探究沉默SOX5对细胞微丝骨架的影响。 2.转录因子SOX5调节RA SFs迁移及侵袭机制的研究 (1)分别使用SOX5低表达慢病毒载体及重组腺病毒SOX5高表达载体转染RA SFs的细胞系MH7A，Real-time PCR及Western blot检测高表达/低表达SOX5后对MH7A中基质金属蛋白酶(MMPs)表达的影响; (2)将重组MMP9因子加入低表达SOX5的RA SFs中，经Transwell小室迁移实验、划痕试验、Transwell小室加基质胶侵袭实验评估外源性补充MMP9是否可以逆转沉默SOX5对细胞迁移及侵袭的抑制作用。 3.转录因子SOX5调控MMP9表达机制的研究 (1)在MH7A中过表达SOX5后，采用ChIP实验检测SOX5是否能与MMP9启动子区相结合。 (2)构建MMP9启动子荧光素酶报告载体，观察过表达SOX5对MMP9启动子转录活性的影响。 (3)采用Real time-PCR法检测低表达、高表达SOX5后，MH7A中与MMP9相关miRNA的变化;使用miR-15a、16 mimics转染高表达SOX5后的MH7A，反向验证miR-15a、16在SOX5间接调节MMP9中的作用及对MH7A迁移性的影响。 4.关节局部沉默Sox5对胶原诱导关节炎小鼠滑膜侵袭性和Mmp9表达的影响 建立胶原诱导关节炎小鼠模型(CIA)，局部关节注射siRNA-Sox5低表达病毒，Real time-PCR、免疫组化检测关节组织中MMP9的表达;组织病理学观察沉默SOX5对滑膜侵蚀软骨的影响。 结果: 1.转录因子SOX5对RA SFs迁移及侵袭能力的影响 在RA SFs中低表达SOX5后，与阴性对照病毒组相比，细胞迁移性和侵袭性显著降低(p＜0.001)，细胞中微丝骨架的重排也明显减弱。 2.转录因子SOX5调节RA SFs迁移及侵袭机制的研究 在与RA SFs迁移与侵袭相关的MMPs家族中，沉默SOX5能显著抑制MMP2、MMP9表达，其中对MMP9的影响最明显，而对MMP1、MMP3的表达无明显影响;过表达SOX5能显著增强MMP9的表达;外源性加入重组MMP9可部分逆转沉默SOX5对RA SFs迁移及侵袭的抑制作用。 3.转录因子SOX5调控MMP9表达机制的研究 ChIP结果显示，在MH7A中高表达SOX5可增加SOX5与MMP9启动子区的结合;萤光素酶报告基因结果显示，在MH7A中高表达SOX5可增强MMP9启动子的转录活性;低表达SOX5可以增高MH7A中miR-15a、miR-16的表达，而高表达SOX5可以抑制miR-15a、miR-16的表达;miR-15a mimics可以抑制高表达SOX5对MH7A中MMP9的诱导作用，抑制MH7A的迁移性。miR-16mimics可以抑制高表达SOX5对MH7A中MMP9的诱导作用，但对MH7A的迁移性无明显作用。 4.关节局部沉默Sox5对胶原诱导关节炎(CIA)小鼠滑膜侵袭性和Mmp9表达的影响 在CIA小鼠关节局部沉默Sox5后，关节组织中Sox5及Mmp9的表达明显减低;HE结果显示低表达Sox5组CIA鼠膝关节滑膜对软骨的侵蚀作用明显减轻。 结论: 1.转录因子SOX5可通过调控RA SFs中MMP9的表达影响滑膜成纤维细胞的迁移和侵袭能力。 2.SOX5可能通过两方面机制调控MMP9表达:SOX5直接与MMP9启动子区结合，调控MMP9的转录;SOX5通过对miR-15a的调控间接影响MMP9的表达。 3.CIA鼠关节局部沉默Sox5能显著抑制关节组织中Mmp9的表达，改善滑膜对关节及软骨的侵蚀作用。 收起