摘要: 目的：随着我国太空事业的发展，宇航员太空活动增多，驻留时间延长，因失重导致的骨质疏松现象加重。同时随着我国社会老龄化的加剧，骨质疏松患者逐渐增多，给患者带来严重的健康问题和经济负担。CKIP-1(酪氨酸激酶相关蛋白酶1)基因是近年来新发现的... 展开 目的：随着我国太空事业的发展，宇航员太空活动增多，驻留时间延长，因失重导致的骨质疏松现象加重。同时随着我国社会老龄化的加剧，骨质疏松患者逐渐增多，给患者带来严重的健康问题和经济负担。CKIP-1(酪氨酸激酶相关蛋白酶1)基因是近年来新发现的骨分化、形成的负调控因子，能够有效对抗失重性及废用性骨质疏松。本文主要探索微重力环境下，CKIP-1基因对小鼠BMSCs细胞增殖、凋亡及成骨分化的影响及分子机制探讨研究，为治疗骨质疏松找到新的方法。 方法： 1、敲除CKIP-1基因的BMSCs（knockout，KO-BMSCs）及正常BMSCs细胞提取：CKIP-1基因小鼠和野生型小鼠杂交繁育后，PCR法鉴定4周龄敲除CKIP-1基因小鼠（Knockout,KO型）与野生型C57BL/6小鼠(wildtype，WT型)，股骨离断用全骨髓法提取两组BMSCs细胞，传代培养，分离，纯化。观察细形态，胞流式细胞学鉴定纯度。并用细胞计数法及MTT法检测正常重力下CKIP-1对细胞增殖影响。 2、将BMSCs细胞（KO-BMSCs及WT-BMSCs）分别在不同重力环境中培养。细胞分为4组分为：①野生型BMSCs细胞正常重力组（wildtype–normalgravity，WT-NG）；②敲除CKIP-1型BMSCs细胞正常重力组(knockout–normalgravity,KO-NG);③敲除CKIP-1型BMSCs细胞微重力组（knockout–microgravity，KO-MG）④野生型BMSCs细胞微重力组（wildtype–microgravity,WT-MG）。微重力环境用体外细胞旋转培养系统（RCCS）模拟，均在体外行成骨诱导培养5天后行相关检测。 3、细胞增殖及成骨分化相关指标检测 3.1MTT测量细胞0、3、5天细胞的增殖 3.2流式细胞学技术及RT-PCR测定Bcl-2基因表达分析各组细胞的凋亡 3.3茜素红染色检测各组细胞的矿化程度 3.4细胞微丝染色 3.5细胞碱性磷酸酶（ALP）浓度测定及染色 3.6RT-PCR检测成骨相关基因的表达 3.7Westernblot检测成骨相关蛋白的表达 结果： 1、敲除CKIP-1基因后，小鼠的生命体征及生长发育未受明显影响。KO-BMSCs细胞和WT-BMSCs在体外可以正常增殖生长。通过传代培养4代后BMSCs纯度可达90%以上。细胞计数显示KO-BMSCs增殖率低于WT-BMSCs组，MTT试验结果显示二者之间未有明显统计学意义； 2.微重力条件抑制细胞增殖及BMSCs向成骨细胞的分化；微重力环境促进细胞凋亡，敲除CKIP-1基因促进了细胞的凋亡； 3.微重力环境中BMSCs细胞由梭形变为圆形，WT-BMSCs形态变化较KO-BMSCs组弱。同时在微重力条件下两组BMSCs细胞的微丝变细，排列紊乱，但敲除CKIP-1基因能有效对抗微丝变化，保持微丝形态； 4.敲除CKIP-1基因后BMSCs细胞成骨分化能力增强，BMP/Smad信号通道表达增强，成骨相关基因及蛋白的表达增强，而微重力环境中该趋势受到抑制。 结论： 1、敲除CKIP-1后小鼠的生命体征及生长发育未受明显影响，敲除CKIP-1基因后小鼠BMSCs增殖率降低； 2、敲除CKIP-1后BMSCs细胞增值率降低，但敲除CKIP-1基因能有效对抗微重力阻碍BMSCs向成骨细胞分化的效应，促进细胞的成骨分化，可以为治疗骨质疏松治疗提供新的思路。 收起