摘要: 目的： 白细胞介素(interleukin，IL)-33是IL-1家族的新成员，而可溶性ST2(soluble ST2，sST2)是IL-33的一个诱饵受体，IL-33主要通过IL-33/ST2信号通路在疾病中发挥生物学功能。肺纤维化疾病是由多种病因导致的肺部纤维化的统称，它包括特发性肺纤... 展开 目的： 白细胞介素(interleukin，IL)-33是IL-1家族的新成员，而可溶性ST2(soluble ST2，sST2)是IL-33的一个诱饵受体，IL-33主要通过IL-33/ST2信号通路在疾病中发挥生物学功能。肺纤维化疾病是由多种病因导致的肺部纤维化的统称，它包括特发性肺纤维化、过敏性肺炎、间质性肺炎、结节病、尘肺、药物或放射线等引起的肺纤维化。它是因为成纤维细胞大量聚集、胞外间质沉积并且伴有炎症反应和损伤，导致的肺组织结构破坏。对于该疾病目前国内外仍然没有有效的治疗药物。研究发现，在特发性肺纤维化病人和博莱霉素诱导的肺纤维化小鼠模型体内sST2和IL-33的表达均升高。因此，本研究拟构建慢病毒表达载体过表达可溶性ST2蛋白，研究ST2在小鼠肺纤维化中的作用及机制。 方法： 1.设计引物从pcDNA3.1-mST2质粒中扩增出全长的小鼠ST2基因，然后将ST2目的基因与 pLVX-IRES-ZsGreen1载体用 Xho I和BamH I限制性内切酶切割，再将pLVX-IRES-ZsGreen1载体大片段和ST2基因回收后，用T4连接酶连接并转化到大肠杆菌感受态细胞中，构建pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体。 2.将构建的pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1重组质粒与慢病毒包装所需的三个辅助质粒共转染到人肾胚(human embryonic kidney，HEK)293T细胞中，进行ST2慢病毒包装，并测定病毒的滴度及活性。 3.建立博莱霉素诱导小鼠肺纤维化模型，将包装的ST2慢病毒上清浓缩后用鼻滴的方法注射到模型小鼠体内，在注射博莱霉素后第7天和第28天分别处死部分小鼠，收集样本，研究ST2对小鼠肺纤维化的影响。通过HE染色检测小鼠肺部炎症的变化；用天狼猩红染色和羟脯氨酸含量检测小鼠肺组织纤维化和胶原纤维含量的变化；通过RT-PCR和ELISA方法检测相关细胞因子及趋化因子含量的变化。 结果： 1.通过PCR成功扩增出了小鼠ST2全长序列，将其插入到pLVX-IRES-ZsGreen1多克隆位点中，成功构建了pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1慢病毒表达载体。 2.将重组质粒pLVX-ST2-IRES-ZsGreen1和辅助质粒共转染到HEK293T细胞中，成功包装出了ST2慢病毒，将其浓缩后滴度可达1011TU/mL，并且该病毒可以在真核细胞中表达ST2。 3.将ST2慢病毒注射到小鼠体内后，可以在小鼠肺组织中过表达可溶性ST2蛋白。小鼠的肺部炎症明显得到缓解，其纤维化程度也较模型组减轻。第7天时ST2使小鼠肺组织中TNF-αmRNA和蛋白、MMP9 mRNA的表达增加，使IL-4，IL-6和IL-13 mRNA的表达量降低。第28天时ST2使MCP-1和MMP12 mRNA的表达降低。另外，注射ST2慢病毒后，小鼠IFN-γmRNA的表达水平在第7天和第28天时均升高。 结论： 成功构建了ST2慢病毒表达载体，将其包装成慢病毒，该病毒能够在真核细胞中表达ST2目的基因。将包装的ST2病毒注射到肺纤维化模型小鼠体内可使可溶性ST2蛋白过表达，对小鼠肺纤维化具有抑制作用，但是其具体机制有待进一步研究。 收起