摘要: 目的:筛选最优抑制大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)中Shh基因表达的siRNA干扰序列，为后续在基因水平上验证Hedgehog信号通路对骨髓基质细胞成骨作用的影响奠定实验基础。 方法:取刚离乳SD大鼠骨髓基质细胞以全骨髓贴壁法进行原代培养和传代培养。将成功构... 展开 目的:筛选最优抑制大鼠骨髓基质细胞(BMSCs)中Shh基因表达的siRNA干扰序列，为后续在基因水平上验证Hedgehog信号通路对骨髓基质细胞成骨作用的影响奠定实验基础。 方法:取刚离乳SD大鼠骨髓基质细胞以全骨髓贴壁法进行原代培养和传代培养。将成功构建的针对Shh基因的三对siRNA干扰序列以慢病毒(lentivirus)为载体转染体外培养的SD大鼠三代骨髓基质细胞，设置转染复数(MOI)分别为100，10，1，转染时间分别为48小时，72小时。荧光显微镜下观察确认最佳MOI值和最佳转染时间，并在最优病毒转染条件下，观察三对LV-siRNA-Shh转染效率。设置未经病毒感染组(CON)、慢病毒阳性干扰组（Shh-siRNA-1056组、Shh-siRNA-619组、Shh-siRNA-832组）和阴性对照感染组(NC)五个实验组，利用Western-blot蛋白印迹技术检测对Shh蛋白最有效的RNA干扰序列组。并用四甲基偶氮唑兰比色法(MTT)分析检测最有效组干扰序列骨髓基质细胞生长活性的改变。 结果:荧光显微镜结果显示:转染复数MOI为1、转染时间为72小时转染效率最高，三组慢病毒阳性干扰组LV-siRNA-Shh中，Shh-siRNA-1056组转染效率最高。Western-blot蛋白印迹技术检测结果显示阴性对照组与未经病毒感染组Shh蛋白表达无明显差异，三组慢病毒阳性干扰组LV-siRNA-Shh均对Shh蛋白表达有抑制作用，其中Shh-siRNA-1056组抑制作用最明显。四甲基偶氮唑兰比色法(MTT)分析结果显示Shh-siRNA-1056组细胞活性与未感染病毒组细胞活性无明显差异(P＞0.05)，没有统计学意义。 结论:LV-siRNA-Shh转染大鼠骨髓基质细胞后对Shh基因表达有抑制作用。Shh-siRNA-1056组抑制作用最明显，且其本身对细胞无毒害作用，可以用于后续实验研究。 收起