摘要: 目的:通过观察急慢性肝损伤模型中肝组织自噬的表达，了解自噬在肝纤维化及HSC活化过程中的作用。以TGF-β1为对象，体外进一步研究以明确HSC自噬与活化之间的关系。筛选有效的中药成分，通过调节HSC自噬，抑制HSC活化。 方法:1.动物实验:采用CCl4腹... 展开 目的:通过观察急慢性肝损伤模型中肝组织自噬的表达，了解自噬在肝纤维化及HSC活化过程中的作用。以TGF-β1为对象，体外进一步研究以明确HSC自噬与活化之间的关系。筛选有效的中药成分，通过调节HSC自噬，抑制HSC活化。 方法:1.动物实验:采用CCl4腹腔注射诱导小鼠急慢性肝损伤模型，DMN腹腔注射诱导大鼠肝纤维模型，Western blot、RT-PCR方法和电镜的方法检测急慢性肝损伤动物肝组织中自噬的表达变化。小鼠急性肝损伤造模后，分离原代mHSC，Western blot检测mHSC中LC3B的表达。分离培养正常mHSC，MDC染色观察不同培养时间自噬小体的表达变化。2.体外实验:采用TGF-β1、丹参酚酸B和白藜芦醇分别干预小鼠HSC株JS-1，研究其对自噬的作用。自噬抑制剂3-MA、CQ及siAtg7干扰抑制自噬，Rapamycin诱导自噬，zVAD-FMK抑制凋亡。BODIPY染色观察原代HSC脂滴变化，MTT检测JS-1增殖，MDC染色和LC3-GFP转染观察自噬小体表达，Western blot和RT-PCR检测HSC活化指标（α-SMA、Col.Ⅰ）、自噬指标(Beclin1、LC3B、Atg5、Atg7)和凋亡指标(Cleaved-Caspase3、Bcl-2、Bax、p53)的表达变化。 结果:1.急慢性肝损伤动物肝脏自噬的观察观察:CCl4诱导的急性肝损伤模型自噬指标LC3BⅡ、p62蛋白表达均增加(P＜0.01);分离CCl4诱导的急性肝损伤小鼠HSC，LC3BⅡ蛋白表达明显增加;正常原代小鼠HSC分离后随培养天数的增加，MDC染色胞浆内蓝色荧光小点表达明显增加。CCl4诱导的肝纤维化模型α-SMA、Col.Ⅰ蛋白及mRNA的表达明显增加，自噬指标LC3BⅡ、Atg7蛋白表达明显增加(P＜0.05，P＜0.01);激光共聚焦显微镜下可观察到LC3B与α-SMA标记的HSC的共定位。急慢性模型肝组织电镜下均可观察到肝细胞内自噬小体。说明CCl4诱导急慢性肝损伤时，小鼠肝脏自噬水平上调。DMN诱导的大鼠肝纤维化模型，α-SMA、Col.Ⅰ、p62蛋白表达均明显增加(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01)。2.TGF-β1通过诱导自噬激活肝星状细胞:TGF-β1刺激JS-1活化，伴自噬水平上调，如LC3BⅡ蛋白(P＜0.05)和Atg5、Beclin1 mRNA的表达增加(P＜0.01)，而抑制自噬能够阻断TGF-β1诱导的JS-1活化。3-MA能够抑制TGF-β1诱导的JS-1增殖（P＜0.01）、α-SMA mRNA的表达(P＜0.01)、Col.Ⅰ蛋白的表达(P＜0.01)及细胞内LC3-GFP荧光小点的表达;CQ能够抑制TGF-β1诱导的JS-1增殖(P＜0.01)、抑制α-SMA、Col.Ⅰ mRNA(P＜0.01)和蛋白(P＜0.01、P＜0.05)的表达及细胞内MDC染色蓝色荧光小点的表达;siAtg7干扰后能明显抑制TGF-β1诱导的Col.Ⅰ蛋白表达(P＜0.01)。同时，Rapamycin也具有抑制TGF-β1诱导的JS-1增殖(P＜0.01)和Col.Ⅰ蛋白表达(P＜0.05)作用。3.丹参酚酸B盐抑制JS-1自噬及活化:浓度为10-5M时能明显地抑制JS-1增殖(P＜0.01)，同时能够明显抑制自噬，如能抑制LC3-GFP荧光小点的表达，及LC3BⅡ蛋白表达(P＜0.01)，加入自噬抑制剂3-MA、CQ和siAtg7干扰能进一步抑制JS-1自噬和活化，表现为LC3BⅡ和Col.Ⅰ蛋白的表达降低(P＜0.01)。4.白藜芦醇诱导JS-1自噬并抑制活化:白藜芦醇能够抑制JS-1活化，抑制JS-1增殖和Col.Ⅰ的表达(P＜0.01)，同时诱导JS-1自噬和凋亡，LC3BⅡ表达增加与p62表达降低(P＜0.01)及C-Caspase3的表达增加(P＜0.01)。阻断JS-1自噬或凋亡能够阻断白藜芦醇抑制HSC活化的作用，3-MA、CQ和siAtg7干扰抑制自噬(P＜0.01)，或zVAD-FMK抑制凋亡(P＜0.05)后，能够逆转白藜芦醇抑制Col.Ⅰ表达的作用。白藜芦醇主要通过SIRT1和JNK抑制JS-1自噬和活化，加入SIRT1阻断剂EX527后能够明显抑制自噬，LC3BⅡ表达降低(P＜0.01)，并阻断白藜芦醇抑制Col.Ⅰ表达的作用(P＜0.01)。加入JNK阻断剂SP600125后能够明显抑制自噬和凋亡，LC3BⅡ和Cleaved-Caspase3表达降低(P＜0.05)，并阻断白藜芦醇抑制Col.Ⅰ表达的作用(P＜0.05)。 结论:1.CCl4诱导的小鼠急慢性肝损伤模型中，肝组织自噬水平上调。2.分离培养急性肝损伤模型小鼠原代HSC，观察到HSC活化伴有自噬的增加。3.TGF-β1可以通过诱导自噬从而激活HSC。4.SA-B能够通过抑制自噬抑制TGF-β1激活HSC。5.白藜芦醇可以通过调控SIRT1和JNK通路诱导自噬，抑制HSC活化。 收起