摘要: 光敏色素是存在于植物和细菌中的感受光的功能色素蛋白，在植物的光形态发生和细菌的趋光性运动中发挥重要作用。蓝细菌光敏色素辅基蛋白通过N末端GAF结构域中的半胱氨酸与藻胆色素(PCB)共价结合形成完整的有生理活性的光敏色素，蓝细菌中存在的光敏色... 展开 光敏色素是存在于植物和细菌中的感受光的功能色素蛋白，在植物的光形态发生和细菌的趋光性运动中发挥重要作用。蓝细菌光敏色素辅基蛋白通过N末端GAF结构域中的半胱氨酸与藻胆色素(PCB)共价结合形成完整的有生理活性的光敏色素，蓝细菌中存在的光敏色素称为蓝细菌光敏色素(CBCRs)。本研究主要内容包括： ⑴根据Nostoc sp.PCC7120的基因组信息，我们获得了50多个CBCRs的GAF结构域。利用蛋白质聚类工具分析这些GAF结构域，发现一个DXCF光受体分支，该分支包含All1688、All2239、All1280 GAF2、All3691 GAF2、Alr1966 GAF2、Alr2279、Alr3356、Alr3120 GAF1、Alr3120 GAF2和Alr5272 GAF1。利用分子生物学技术，将这些DXCF光受体分别与PCB在E.coli BL21中共表达，得到了8个能与色素共价结合的DXCF CBCRs，其中，仅Alr3120 GAF1没有可逆光效应，其余7个DXCF CBCRsAll1688、All1280 GAF2、All2239、All3691 GAF2、Alr1966 GAF2、Alr2279和Alr3356均表现出不同的可逆光效应。这7个CBCRs的15Z态在410～430 nm有吸收峰，而15E态在490～600 nm的长波范围有吸收峰，由于其15Z态在蓝光区有吸收峰而称之为蓝光光受体。根据CBCRs结合色素的类型，将8个DXCF CBCRs分为3种类型:(1)结合PCB/TPcR的DXCFCBCRs，包括All1688、All2239、Alr3356和Alr3120 GAF1;(2)结合PVB/TPvR的DXCF CBCRs，All3691 GAF2属于这种类型;(3)结合PCB/TPcR与PVB/TPvR混合色素的DXCF CBCRs，包括All1280 GAF2、All3691 GAF2和Alr1966GAF2。通过定点诱变技术，研究了结合藻胆色素的保守性半胱氨酸Cc和Cx的功能。将DXCF CBCRs中的Cc突变后， All2239(C82L)、 All3691 GAF2(C87I)和Alr2279(C100I)在可见光区没有吸收峰，未能结合色素，而All1280 GAF2(C81 A)和Alr1966 GAF2(C84A)在可见光区仅有微弱的吸收峰，与野生型相比大大降低，由此表明Cc在DXCFCBCRs的色素稳定结合中起重要作用。在DXCFCBCRs中，还存在另一个结合色素的保守性半胱氨酸Cx，Cx位于CBCRs的DXCF基序中，该Cys与藻胆色素形成第二个结合色素的硫醚键，第二个硫醚键的形成中断了藻胆色素的共轭体系，从而形成了类胆红素TPcR或TPvR，TPcR或TPvR赋予DXCF CBCRs在蓝光区的吸收峰。定点突变DXCF CBCRs的Cx后，所有Cx突变体在420 nm附近的吸收峰消失，在560～650 nm范围内的吸收峰升高，蓝光区吸收峰的消失表明TPcR或TPvR的形成受到抑制，从而确证了Cx与色素的C-10共价结合。 ⑵扫描DXCF CBCRs的荧光光谱，6个具有可逆光吸收效应DXCF CBCRs均在630～660 nm范围内有红色荧光发射峰，其荧光发射光谱在15Z/15E态之间也表现不同程度的可逆效应，其中，All1280 GAF2具有红色荧光/无荧光变化，其可逆荧光效应尤为明显。大多数DXCF CBCRs的Cx突变体在640～660 nm有荧光发射峰，其荧光发射峰与野生型相比有不同程度的红移，且Cx突变体的荧光活性均高于野生型DXCF CBCRs。由于All1280 GAF2(C53A)和Alr1966 GAF2(C56A)具有较高的荧光活性和摩尔消光系数，在荧光显微镜下检测到了两种色素细胞持续的红色荧光。然而，All1280 GAF2的荧光发射光谱虽然显示有明显的红色荧光/无荧光变化，但是在荧光显微镜下我们仅检测到了All1280 GAF2细胞微弱的可逆红色荧光。利用定点突变技术对All1280 GAF2进行分子改造，得到的突变体均没有较强的荧光活性。 ⑶在对蓝细菌光敏色素All4261的光化学性质的研究工作中，发现All4261全蛋白的表达量不高，且不溶于水。为了便于对All4261的光谱性质进行研究，我们研究了All4261中4个GAF结构域的光化学性质，结果表明仅All4261 GAF2能与PCB共价结合。All4261GAF2的吸收峰为590nm荧光发射峰为645 nm，其Cys突变体All4261GAF2(C81L)、All4261 GAF2(C113A)均具有较高的吸收和荧光活性，而突变体All4261GAF2(C124L)在可见光范围没有特征性吸收荧光峰，因此Cys124为All4261GAF2结合PCB色素的位点。 ⑷研究了Synechocystis sp.PCC6803中Slr0351的功能。利用同源重组技术构建了△slr0351突变藻。比较△slr0351突变藻与野生型(WT)在不同培养条件下的生长速率差异，我们发现△slr0351突变藻对缺S和缺N胁迫条件十分敏感，由此推测slr0351可能参与S元素和N元素的生物化学代谢调控过程。同时我们还发现slr0351的缺失对藻细胞在弱光照条件下的光能捕获效率有较大影响，而不影响强光条件下藻细胞的光能捕获效率。切除Slr0351N末端的跨膜结构，在E.coliBL21中成功表达了Slr0351截短蛋白，以便于对Slr0351的性质及功能进一步开展研究。 收起