摘要: 近年，随着人类基因组序列图完成及分子生物学技术的发展，几乎所有凝血蛋白及血小板膜蛋白等基因已被克隆，这有助于深入了解探索其结构与功能的关系。目前已发现很多遗传性出血性疾病的基因异常，基因诊断是今后遗传性出血性疾病研究的发展方向。遗... 展开 近年，随着人类基因组序列图完成及分子生物学技术的发展，几乎所有凝血蛋白及血小板膜蛋白等基因已被克隆，这有助于深入了解探索其结构与功能的关系。目前已发现很多遗传性出血性疾病的基因异常，基因诊断是今后遗传性出血性疾病研究的发展方向。遗传性凝血因子Ⅶ缺陷为常染色体隐性出血性疾病，其发病率约为1/500000，仅次于血友病A、B，而且临床表现迥异。Wiskott-Aldrich综合征是WASP基因突变所致的X连锁隐性遗传病，其临床特征为血小板减少伴小血小板，湿疹及免疫缺陷等。本研究对7例遗传性凝血因子Ⅶ及7例Wiskott-Aldrich综合征的家系成员进行基因诊断并对其致病机制进行研究。本研究分为两部分： 第一部分遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子机制研究 第一节：7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者及家系成员的临床与F7基因突变的研究 用一期法及ELISA检测PT、凝血因子Ⅶ活性及抗原等凝血指标进行表型诊断；用DNA测序方法对先证者及家系成员F7基因的全部外显子、侧翼区及5'和3'非翻译区进行分析，寻找基因突变位点；应用PCR-RFLP对新发现地突变的先证者及其家系成员相应基因片段进行酶切分析，证实测序所发现地突变；利用长链PCR分析无突变患者的基因组DNA排除大片段缺失；并用剪接分析软件分析剪接位点突变后效应。 在7例遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症患者中，PT明显延长，FⅦ活性水平均降低(<5％)，FⅦ抗原水平改变不一致，有的明显下降，有的仅轻度降低，其他凝血指标均正常；7例遗传件FⅦ缺陷患者中发现7种基因突变和3种F7基因多态性，其中18094C→T(Gln426X)、16750 C→T(Ser250Phe)(以ProFⅦ的Met为+1位)为国际首次报道，His408Gln，5076-5077 Del CT两种纯合突变为国内首次报道，15975G→A(IVS6-1G→A)、16039 G→A(Arg212Gln)，17908 G→A(Arg364Gln)国际均已见报道，IVS6-1G→A突变重复出现于4个无亲缘关系的家系，His408Gln在两个无血缘关系的家庭中。除两例纯合突变外，其余均为双重杂合性突变：1例新的基因多态性10081 C→T，其杂合率为4％。其中5076-5077 Del CT纯合子、Gln426X与IVS6-1G→A双杂合子患者临床出血表现较重；Ser250Phe与IVS6-1G→A、His408Gln与Arg212Gln双杂合子患者出血症状较轻；His408Gln纯合子、Arg364Gln与IVS6-1G→A双杂合子及仅发现IVS6-1G→A突变的患者及家系成员无明显临床出血表现。 从上述结果可得出以下结论，7例遗传性FⅦ缺陷患者中发现了7种基因突变，其中2种突变为国际首次报道；IVS6-1G→A可能为中国汉族人的热点突变；但F7基因突变、FⅦ活性及抗原水平及临床表现无明显相关性。 第二节新的错义突变Ser250Phe致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷的分子机制 Ser250Phe发生于FⅦ的丝氨酸蛋白酶活性中心附近，影响蛋白构象，使其活性及分泌合成受到影响。利用正常肝组织提取的mRNA构建正常(野生)FⅦ cDNA真核表达载体(pcDNA3.1)，在此基础上利用PCR介导的质粒定点诱变技术，用一对反向互补的突变引物PCR扩增后，Dpn I消化模板，然后转化到感受态细胞(DH5α)中修复。用脂质体法(Lipofectamine2000)分别转染HEK293和CHO细胞，通过体外表达FⅦ活性及抗原的测定、Western Blotting分析、高尔基/内质网定位的质粒及免疫荧光技术及分子模型分析等方法研究Ser250Phe致遗传性凝血因子Ⅶ缺陷症的分子机制。 研究结果显示突变体Ser250Phe转染细胞后，在细胞裂解液中能检测到与野生型一致的FⅦ抗原量，但细胞培养上清中仅有极微量的FⅦ活性及抗原；亚细胞定位分析中，突变体能与内质网及高尔体共定位；分子模型分析示Ser250被较大侧链疏水的Phe替代后，改变了氢键位置并增大空间位阻，可能破坏了FⅦ的空间构象。 从上述研究结果可推出以下：Ser250Phe突变体构象改变，在细胞内能正常合成，而且能从内质网转运至高尔基体，但分泌障碍而导致FⅦ的表达降低。 第二部分7例Wiskott-Aldrich综合征的临床特点和基因分析 用流式细胞术、免疫比浊法及血细胞分析仪分别检测各患者细胞免疫功能、体液免疫功能及血小板计数及平均血小板体积；用DNA测序方法分析各患者WASP基因的外显子、侧翼区与3’与5’非翻译区，寻找基因突变，并与人类基因突变数据库比较。 7例Wiskott-Aldrich综合征患者均有皮肤粘膜的出血表现，反复感染高热，湿疹及反复腹泻，均无自身免疫疾病及肿瘤，临床评分为3或4分；骨髓检查均提示免疫性血小板减少性骨髓象；血小板均减少伴体积偏小，均有贫血且提示小细胞低色素性贫血，白细胞偏高；绝大部分患者(6/7例)的CD3+细胞减少，CD4+/CD8+比值紊乱，B细胞及NK细胞的比例正常；绝大部分患者(6/7例)的IgG升高，而IgA全部升高。在7例Wiskott-Aldrich综合征患者中发现了6种基因突变，除6783 C→G(Tyr102stop)突变发生于外显子3；另外5种突变均发生在外显子10，10250C→T(Gln440stop)，10216-10221 Ins G与9964 Del T均导致框移，分别于aa494圾aa440处提前终止，10192-10203 Del GCCTGCCGGGG，10052-10059 Del GCTACTG均为小片段的缺失致框移；前三种突变患者母亲均为携带者，后二者母亲均为正常人，属于散发的病例；有一例患者虽然有WAS的临床表现，但现行的方法未能找到突变位点。 从上述结果可以看出，Wiskott-Aldrich综合征患者的血小板均减少且伴体积减小，但免疫功能及骨髓象改变变化较大，不具有诊断及预后价值；在基因检测中，发现了5例国际首次报道的突变，而且有两例散发的病例，这些突变均为无义及小插入或缺失突变。这些基因突变类型及位点与临床表现有一定的关系。 收起