摘要: 生长激素(GH)在动物生长发育过程中扮演着重要角色。GH蛋白通过结合两个生长激素受体(GHR)分子的膜外区,使其形成活化的二聚体形式,从而激活下游的JAK2/STAT信号,这一信号通路被称作GHR信号通路。 基于对GH生物学功能的认识,人们通过外源GH基因的转... 展开 生长激素(GH)在动物生长发育过程中扮演着重要角色。GH蛋白通过结合两个生长激素受体(GHR)分子的膜外区,使其形成活化的二聚体形式,从而激活下游的JAK2/STAT信号,这一信号通路被称作GHR信号通路。 基于对GH生物学功能的认识,人们通过外源GH基因的转移获得了具有显著快速生长效应的转基因动物。然而,在转基因鱼的研究中,这一促生长效应在不同物种或同一物种的不同遗传群体间存在显著差异。研究显示,GHR信号通路的负反馈效应在GH转基因鱼体内起着重要作用。这提示我们在今后的转基因实践中,可以从信号通路整体活化的层面来进行目标转植基因的选择和设计。 另一方面,虽然对GH和GHR信号通路在动物后期生长和代谢过程中的重要作用已有深入的研究和认识,而且不同学者的研究已或多或少地显示GHR信号通路相关因子在胚胎发育早期已存在表达,但是,对于GHR信号通路在早期胚胎发育过程中的作用尚缺乏研究且没有定论。 本论文针对以上两个科学问题,以斑马鱼为模型,开展了如下的研究: 1.系统分析了GHR信号通路相关因子gh,ghr,jak2a,jak2b,star5.1,stat5.2,igfl,c-fos,socs1,socs2等在胚胎发育的不同阶段和成体不同组织的表达模式,结果表明这些基因都存在母源性表达,大多基因的合子表达起始于体节发育早期,提示GHR信号通路在胚胎发育早期起到重要作用。此外,在成体组织中,socs基因的表达水平和GH靶基因的表达水平呈某种程度的负相关。 2.通过GHR信号通路两个靶基因igfl和c-fos的定量PCR分析,以及GHR信号通路应激启动子spi2.1的活性分析,结合GH和GHR表达载体等多因子共注射,建立了在斑马鱼早期胚胎中评价GH信号通路活化水平的体内研究模型。gh或ghr单独过表达均能够显著激活发育到1-3天的早期胚胎中的GHR信号通路,gh和ghr的协同过表达可以放大其单独过表达对GHR信号通路的激活效应,这强烈显示在行使生物学功能的垂体形成之前,鱼类早期胚胎中已开始表达具有生物学活性的GH和GHR蛋白。 3.通过人为设计的亮氨酸拉链结构替代GHR的膜外区可形成激活型的GHR分子(CA-GHR),过表达CA-GHR非常显著地促进GHR信号通路的活化,且这一激活效应远远高于gh和ghr协同过表达的效应。通过转基因技术获得了CA-GHR转基因斑马鱼,CA-GHR转植基因在转基因鱼体内多种组织中忠实表达,且能够显著激活igfl和c-fos这两个靶基因的表达,并相应地促进转基因鱼的生长。 4.设计了一个C-端胞内信号传导区缺失的GHR分子(AC-GHR),过表达AC-GHR可以显著抑制GHR信号通路的活化水平。此为GHR的显性负调控形式(DN-GHR),利用DN-GHR过表达技术可以在早期胚胎中高效地抑制GHR信号通路。通过向斑马鱼胚胎注射入体外合成的CA-GHR和DN-GHR mRNA,分别获得GHR信号通路被激活和抑制的胚胎。 5.对发育至原肠期到1天的胚胎的表型分析并结合分子探针标记的研究表明,激活和抑制GHR信号通路均导致胚胎原肠运动的障碍；激活GHR信号通路导致早期胚胎发育的背部化,抑制GHR信号通路导致腹部化。对发育到2-3天的胚胎的进一步分析表明,激活和抑制GHR信号通路均可能导致肝脏形成失败或者诱导形成多个肝脏原基,且这一效应和对胰腺内分泌细胞的效应不一致,因为激活和抑制GHR信号通路均不会诱导产生多个内分泌胰腺原基；对心脏特异标记的分析表明,GHR信号通路对肝脏形成的作用是独立于躯体左右不对称决定之外的,因为激活和抑制GHR信号通路均能破坏斑马鱼胚胎心脏位置的左右不对称性,但不会产生多个心脏原基。 综上所述,本论文的研究建立了一个利用斑马鱼胚胎分析GH信号通路活化水平的体内研究模型；发现在具有生物学功能的垂体形成之前的胚胎中已开始表达具有生物学活性的GH和GHR蛋白；第一次设计构建了激活型GHR转基因鱼模型,为日后的快速生长转基因动物培育提供了新的思路；发现了GHR信号通路对鱼类早期胚胎发育原肠运动和背腹轴形成的重要作用；发现了GHR信号通路在鱼类肝脏形成和左右不对称形成中的重要作用。 收起