摘要: 本研究以体细胞胚离体再生率较高的紫花苜蓿种质保定为试验材料,建立高效的遗传转化受体系统,并在此基础上构建了磷酸甘露糖安全转基因体系。以期为今后利用生物技术手段对紫花苜蓿的遗传改良提供有利条件。主要研究结果如下: 分别从基因型、外植体... 展开 本研究以体细胞胚离体再生率较高的紫花苜蓿种质保定为试验材料,建立高效的遗传转化受体系统,并在此基础上构建了磷酸甘露糖安全转基因体系。以期为今后利用生物技术手段对紫花苜蓿的遗传改良提供有利条件。主要研究结果如下: 分别从基因型、外植体类型、植物激素配比三个方面分析影响紫花苜蓿体胚离体再生体系建立的因素。选取保定苜蓿为试验材料,将其成熟胚的子叶和下胚轴切除,以子叶节为外植体,诱导培养基的配方是在改良SH(MSHO)的基础上设计不同浓度植物激素的正交试验,生长激素2,4-D浓度为1、2、3、4mg/l,植物细胞分裂素KT浓度为0、0.05、O.1、0.5mg/l。结果表明在2,4-D浓度为2mg/l、KT浓度为0.1mg/1时,胚性愈伤组织的诱导率最高达70.1%(p＜0.05)是紫花苜蓿体胚离体再生适宜的激素配方。 选用五种体胚发生率较高的苜蓿种质:保定、创新、超级13R、劳博、中苜一号为试验材料,以成熟胚子叶节为外植体在2,4.D浓度为2mg/l、KT浓度为O.1mg/l时,测定体胚发生率,研究不同种质紫花苜蓿对体胚离体再生体系建立的影响,结果表明保定的胚性愈伤组织发生率最高达62.7%,其他四个种质依次为创新37.8%、超级13R17.3%、劳博8.0%、中苜一号2.8%(p＜0.05)。说明苜蓿基因型差异对体胚发生率有显著影响,保定可能拥有体胚再生有利基因。 取保定苜蓿幼苗的子叶、下胚轴和成熟胚的子叶节为外植体,在前期摸索的适宜培养条件下诱导胚性愈伤组织,研究外植体选择对体胚离体再生体系建立的影响,发现下胚轴的效果最佳平均体胚发生个数为4.65个、子叶其次为3.5个、成熟胚最低为2.7个(p＜0.05)。 以磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)为选择标记的植物表达载体的构建。大肠杆菌中克隆的pmi基因与pGEM-T Easy构建重组质粒pGEM-T-pmi。酶切鉴定与已报道的pmi基因序列的同源性为99%,氨基酸序列与已报道的同源性为100%。表明克隆的片段为大肠杆菌的pmi基因。之后用限制性内切酶XhoⅠ酶切质粒pCAMBIA1301的hpt基因,将线性质粒pCAMBIAl301进行去磷酸化处理,之后用T4DNA连接酶进行连接。检验其连接方向,筛选出正向连接质粒,鉴定为的pCAMBIA1301-pmi质粒。 农杆菌介导质粒pCAMBIA1301-pmi对紫花苜蓿的遗传转化。首先确定筛选培养基中甘露糖和蔗糖的浓度配比。在含2mg/l2,4.-D和0.1 mg/l KT的MSHO培养基中,设计甘露糖/蔗糖的处理浓度为(g/L):30/10;20/10;10/20:0/30g。试验结果表明30g/l甘露糖和0g/l蔗糖组合时能较好的抑制胚性愈伤组织的生长,其愈伤组织平均鲜重(g)为0.17,浓度配比为20/10时为0.25,10/20时为0.28。将pCAMBIA1301-pmi质粒电转化到农杆菌LBA4404中,并制备农杆菌侵染液。诱导愈伤组织3天后用农杆菌侵染外植体,共培养4天,之后用无菌水冲洗外植体,将其移植到含甘露糖的筛选培养基中,转化个体继续生长,非转化个体褐化死亡。用氯酚红法检测转化率结果为29.2%。 由此得出紫花苜蓿适宜的遗传转化受体系统是以保定苜蓿幼苗的下胚轴为外植体,以含有2mg/12,4-D和0.1 mg/l KT的改良SH(MSHO)为配方建立的体胚离体再生体系。将构建好的重组质粒通过农杆菌转入苜蓿中后在甘露糖浓度为30g/1的筛选培养基中得到转基因体胚,并将其移植再生。 收起