摘要: 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，以下简称肝癌或HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。其预后差，总体疗效仍很不理想。近年来肝癌研究的一个主要进展是分子靶向治疗。肝癌的发生发展是多因素、多步骤的复杂过程。进一步探索肝癌的发病机制，了解其... 展开 肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma，以下简称肝癌或HCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。其预后差，总体疗效仍很不理想。近年来肝癌研究的一个主要进展是分子靶向治疗。肝癌的发生发展是多因素、多步骤的复杂过程。进一步探索肝癌的发病机制，了解其生物学特性，是寻找新的有效治疗靶点的基础。虽然肝癌发病的分子机理目前尚不十分清楚，但近年来发现DNA序列以外的调控机制(即表观遗传学)异常在肿瘤的发生发展过程中起着非常重要的作用。其中，DNA甲基化和microRNA(miRNA)与肝癌发生的关系是目前研究最为深入的表观遗传学机制。DNA甲基化是表观遗传修饰一种主要形式，研究显示基因启动子异常甲基化是肿瘤形成过程中的一个早期、频发事件。目前在多种人类恶性肿瘤中发现以多个基因同时甲基化为特征的CpG岛甲基化表型(CpG Island MethylatorPhenotype，CIMP)。研究表明，许多单个基因的异常甲基化与肝癌的临床预后有关。CIMP在肝癌的发生也扮演着重要的角色。检测肿瘤相关基因的甲基化状态可以为肿瘤的早期诊断、肿瘤分型，预测肿瘤复发、转移和判断预后提供非常有价值的信息。miRNA是一类高度保守的，长约22个核苷酸的非编码小分子RNA。它主要通过与靶标基因3'非翻译区(3'-untranslated region，3'UTR)的完全或不完全配对，降解靶标基因mRNA或抑制其翻译，从而广泛参与调控个体生长发育、细胞凋亡、增殖及分化等生命活动。越来越多的证据显示miRNA在肿瘤的发生发展中起着重要的作用。miRNA可通过调控其靶标基因参与的信号通路，发挥着类似于癌基因或抑癌基因的功能。目前报道许多miRNA都与肝癌的发病有关。此外，miRNA作为高度组织特异性的标志物，在不同肿瘤中具有特定的表达模式，具备鉴别肿瘤类型和起源的潜能。显然，深入研究miRNA将有助于我们进一步阐明肝癌发病的分子机制，未来仍需要发现和探索更多与肝癌发病、诊断、预后有关的miRNA。 本文探讨CIMP和miRNA能否作为肝癌预后和诊断分子标志物应用于临床。另外，初步探讨miR-130b在肝癌发病过程中的作用。从而为寻找肝癌新的分子标志物，寻找新的潜在分子治疗靶点提供新的思路和依据，为进一步阐明肝癌发病机制奠定基础。本研究分为三个部分： 第一部分：CpG岛甲基化表型作为肝细胞癌预后分子标志物的研究。 目的：目前在多种人类恶性肿瘤中发现以多个基因同时甲基化为特征的CpG岛甲基化表型(CIMP)。研究表明，CIMP在肝癌的发生也扮演着重要的角色。本研究探讨CIMP与肝癌临床病理因素和预后之间的关系，以了解CIMP能否作为肝癌的预后分子标志物。 方法：本研究采用甲基化特异性PCR的方法分析10个抑癌基因在115例肝癌组织和48例癌旁肝组织以及10例正常肝组织中的甲基化情况，结合患者的临床病理学特征及随访资料，对患者的术后总生存(Overall survival，OS)和无复发生存(Recurrence-free survival，RFS)进行单因素Kaplan-Meier生存分析及多因素Cox回归分析。 结果：在10个基因中，p16INK4a、p73、GSTP1、MGMT、RARβ和SOCS-1基因启动子的甲基化频率，肝癌显著高于癌旁肝组织(P＜0.001、P=0.010、P=0.003、P＜0.001、P=0.003和P=0.010)。115例肝癌中，其中68例(59.1％)归为CIMP+组(6个或者更多的基因甲基化)，47例(40.9％)归为CIMP-组(五个或以下基因甲基化)。生存分析显示在全组肝癌患者中CIMP+组与CIMP-组预后无显著差异；分层分析表明TNM I期肝癌患者中CIMP+组预后较CIMP-组差，多因素Cox回归分析表明CIMP+是TNMⅠ期肝癌患者总生存和无复发生存独立预后因素[OS(HR，12.266；P=0.015);RFS(HR，2.275；P=0.032)]。 结论：CIMP+的TNMⅠ期肝癌患者行手术切除后预后不良。CIMP可能可以作为一个区分TNMⅠ期肝癌患者预后的工具，并可以鉴定高危复发患者。 第二部分：MicroRNA作为诊断标志物用于鉴别肝局灶性结节增生与肝细胞癌的研究。 目的：肝局灶性结节增生(Focal nodular hyperplasia，FNH)和肝癌是临床上常见的两种肝占位性病变，毫无疑问，准确鉴别两者非常重要;但在某些情况下，无论是通过影像学还是病理学的检查手段，鉴别这两种截然不同性质的肝占位性病变却相当困难。本研究目的是寻找能用于鉴别诊断FNH和肝癌的特异miRNA标志物。 方法：共分成两个阶段和三个病例组。在训练阶段，第一组(cohort A)包括14对FNH和40对肝癌标本，用于miRNA芯片研究两者的表达谱和初步筛选候选miRNA；第二组(cohort B)包括28对FNH和60对肝癌标本，采用实时定量PCR方法，用于验证芯片结果并基于候选miRNA建立一个诊断风险评分，并评估其灵敏度、特异度等。在验证阶段，我们应用第三组(cohort C)前瞻性收集的12对FNH和36对肝癌标本，对从训练集得到的诊断标签进行盲法验证。 结果：miRNA芯片结果表明FNH和肝癌miRNA表达模式有明显区别。其中5个候选miRNA，包括1个在FNH中上调的miR-142-3p，和4个在肝癌中上调的miRNA(miR-17、miR-20a、miR-92a和miR-25)，经实时定量PCR得到验证。逐步logistic回归分析发现miR-142-3p、miR-92a和miR-25是组织学诊断的独立预测因素。由这3个miRNA构成的诊断标签，在训练集中对FNH和肝癌具有良好的鉴别能力，其受试者操作特征曲线下面积(Area under the receiver operatingcharacteristic curve，AUC)为0.912。该诊断模型在验证集中同样有很好的鉴别能力，其AUC为0.887。 结论：我们的结果表明FNH和肝癌具有不同的miRNA表达模式。我们建立和验证了一个独特的基于miRNA标志物的诊断标签，有助于疑难病例中两种肝占位性病变的鉴别。 第三部分：miR-130b在肝细胞癌发病中作用的初步研究。 目的：前一部分芯片研究中，我们对肝癌的miRNA表达谱进行了研究，结果发现miR-130b的表达在肝癌中发生显著上调。本研究进一步探讨miR-130b表达变化与肝癌临床病理因素和预后之间的关系，并研究miR-130b对肝癌细胞生物学特性的影响，探讨其在肝癌发病过程中的作用。 方法：采用实时定量PCR检测107例肝癌和癌旁组织中miR-130b的表达水平，分析其表达与临床病理特征及预后的关系。采用miR-130b inhibitor转染肝癌细胞，CCK-8法和低密度集落形成实验检测细胞生长和增殖能力，流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布。 结果：miR-130b在肝癌组织中表达显著上调，其中74.8％(80/107)的病例癌组织的表达高于其相应癌旁组织(中位值2.22倍，P＜0.001)。miR-130b表达与肿瘤大小显著相关，大肿瘤在miR-130b高表达组中较miR-130b低表达组更多见(P=0.042)。miR-130b高表达是肝癌患者总生存和无复发生存的独立预后因素[OS(HR,2.076；P=0.047)；RFS(HR,3.203；P＜0.001)]。与对照组相比，下调肝癌细胞miR-130b表达后，可显著抑制肝癌细胞的增殖和集落形成能力。流式细胞术检测结果显示下调肝癌细胞miR-130b表达对细胞凋亡率和细胞周期比例无明显影响(P＞0.05)。 结论：miR-130b表达上调与肝癌患者预后不良有关，可能可以作为肝癌预后的分子标志物。miR-130b可能参与了肝癌发病的过程。 收起