摘要: 背景：组织工程化骨在大段骨缺损修复中的应用日益广泛，但是保持其回植后细胞的营养以及尽快建立血供却逐渐成为影响其疗效的瓶颈之一。骨形态发生蛋白—2(BMP-2)的成骨作用早已获得公认，内皮细胞生长因子(VEGF)可以促进血管形成进而促进血管化，但是... 展开 背景：组织工程化骨在大段骨缺损修复中的应用日益广泛，但是保持其回植后细胞的营养以及尽快建立血供却逐渐成为影响其疗效的瓶颈之一。骨形态发生蛋白—2(BMP-2)的成骨作用早已获得公认，内皮细胞生长因子(VEGF)可以促进血管形成进而促进血管化，但是其诱导形成的新生血管欠成熟，结构较差，而血管生成素-1(Ang-1)可以促进新生血管的成熟。 目的：通过引入促进血管化的生长因子加速组织工程骨植入体内后的血管化和整合过程，从而改善其修复骨缺损的效果。 材料和方法：应用磷酸钙共沉淀法制备Ad.VEGF重组腺病毒，将鉴定好的病毒克隆进一步扩增、纯化和测定滴度。用各种病毒载体转染兔骨髓间基质干细胞(rBMSC)鉴定病毒载体功能，同时摸索合理的转染滴度。然后以不同载体和不同滴度的配比转染BMSC，观察细胞在不同转染和培养方式下的增值和分化，以选择合理的转染方式和培养方式。以转染Ad-BMP-2和Ad-Bic的rBMSC或未转染的BMSC复合到β-TCP材料上，以确定确定合理的接种密度和体外培养时间。用不同组合基因修饰的rBMSCs构建组织工程复合体，观察其在裸鼠体内成血管和成骨过程。用不同组合基因修饰的rBMSCs构建组织工程复合体，植于家兔前臂骨缺损中，观察其影像学、组织学及力学变化。 结果：构建的复制缺陷重组腺病毒Ad-VEGF转染效率高、毒性低，体外使用安全。各病毒载体在rBMSCs内均可稳定转染和表达，在同时引入多个基因的情况下，分别用各载体转染之后共培养，其效果优于多载体共转染，并且Ad-BMP-2转染的细胞与Ad-VEGF或Ad-Bic转染的细胞比例为4：1左右最为适宜。细胞接种到支架材料后可在材料内黏附并增殖，当细胞接种时的浓度为2×107/ml时的黏附率较为理想，超过此浓度则表现为过饱和。另外根据细胞增殖的观察，体外培养在7天到天以后细胞增殖渐转为平台增长期。裸鼠实验中，联合应用Ad-BMP-2与Ad-VEGF/Ang-1(Ad-Bic)组、联合应用Ad-BMP-2与Ad-VEGF组和单用Ad-BMP-2组有异位骨形成，其他各组均无成骨。联合应用Ad-BMP-2与Ad-VEGF/Ang-1(Ad-Bic)组成骨和成血管优于联合应用Ad-BMP-2与Ad-VEGF组，后者又优于单用Ad-BMP-2组。兔体内大段骨缺损中，对各组不同时间点的影像学表现进行分析亦提示联用组可获得更好和更快的骨修复，缺损部位的脱钙切片HE染色亦支持此结果。所有实验中均未见肿瘤形成。 结论：两种病毒载体应用时，以分别转染后共培养效果较好，当同时引入Ad-BMP-2和Ad-VEGF或Ad-Bic时，二者比例以4：1左右为适；不论转染与否，细胞均可在β-TCP表面黏附并增殖，且不影响其功能。接种应以体外培养第七天或第八天是操作较为适宜，接种时细胞浓度2×107/ml左右为宜；联合应用BMP-2，VEGF和血管生成素-1可以产生有效的协同作用，从而显著改善细胞支架材料在裸鼠体内的血管化和成骨过程，其效果优于任何单用甚至二者联用的效果。联合应用BMP-2，VEGF和血管生成素1对自体BMSC进行基因修饰，用于组织工程骨的构建，可有效利用三种因子的协同和互补作用，从而实现更好的血管化和成骨目的，同时为其他组织的工程化构建提供参考。 收起