摘要: 目的：通过不同辅料炮制的淡豆豉中大豆异黄酮HPLC指纹图谱及含量变化，比较不同辅料对淡豆豉炮制过程的影响，揭示淡豆豉的炮制机理。在此基础上，建立淡豆豉样品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素多指标成分含量测定的方法，为科学评价与有效... 展开 目的：通过不同辅料炮制的淡豆豉中大豆异黄酮HPLC指纹图谱及含量变化，比较不同辅料对淡豆豉炮制过程的影响，揭示淡豆豉的炮制机理。在此基础上，建立淡豆豉样品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素多指标成分含量测定的方法，为科学评价与有效控制河北产淡豆豉药材的质量提供科学依据。 方法： 1. 指纹图谱的建立： (1)提取：比较了不同提取溶剂、不同提取方法及不同提取时间的提取效果，选择提取成分较多，提取率较高的提取条件，并对提取物进行纯化。 (2)色谱条件：选用合适的色谱柱及检测波长，调整流动相的组成、配比，调节柱温，使色谱图符合指纹图谱研究的要求。 (3)系统适用性试验：在已确定的色谱条件下，考察指纹图谱中染料木苷峰的分离度和理论板数。 (4)稳定性试验：取样品溶液分别于0，4，8，12，24，48h 进样，记录保留时间和峰面积。 (5) 精密度试验：取同一份样品溶液，重复进样6次，记录保留时间和峰面积。 (6) 重复性试验：取同一批淫羊藿炮制淡豆豉药材6份，平行制备样品溶液，进样，记录保留时间和峰面积。 (7) 指纹图谱的建立：分别取不同批次的不同辅料炮制的淡豆豉和黑豆样品，制备供试品溶液，进行指纹图谱分析。 (8) 炮制辅料图谱的建立：分别取淫羊藿、青蒿、桑叶药材，制备供试品溶液，进样，得到各药材图谱。 2.总异黄酮成分的含量测定： (1)测定波长的确定：取对照品溶液及供试品溶液适量，以相应试剂作空白，照紫外.可见分光光度法，在200～800nm波长范围内进行光谱扫描，考察最大吸收波长。 (2)标准曲线的绘制：配制系列浓度的染料木素对照品溶液，分别测定吸收度，以吸收度为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。 (3)稳定性试验：取样品溶液放置0，4，8，12，24，48h后测定吸收度。 (4)精密度试验：取同一份样品溶液，重复6次，测定吸收度。 (5)重复性试验：取同一批次淫羊藿炮制淡豆豉药材，平行制各样品溶液6份，分别测定吸收度。 (6)回收率试验：取已知总异黄酮含量的药材适量，分别加入适量的染料木素对照品溶液，各平行制备三个不同浓度，每个浓度的样品分别平行3份，测定总异黄酮的含量。 (7)样品测定：在上述条件下，测定10批河北产不同辅料炮制淡豆豉及黑豆原料中大豆异黄酮的含量。 3. 四种大豆异黄酮成分的含量测定： (1)标准曲线的绘制：配制系列浓度的染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元对照品溶液，分别进样，测定峰面积；以染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元的含量为横坐标，相应的峰面积为纵坐标，分别绘制标准曲线。 (2)稳定性试验：取样品溶液分别放置0，4，8，12，24，48h后进样，测定峰面积。 (3)精密度试验：取同一份样品溶液，重复进样6次，测定峰面积。 (4)重复性试验：取同一批次淡豆豉药材平行制备样品溶液6份，分别进样，测定峰面积。 (5)回收率试验：取已知大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的淡豆豉药材适量，分别加入适量的大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素对照品溶液，各平行制备三个不同浓度，每个浓度的样品分别平行3份，测定大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量。 (6)最低检测限的确定：将大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素对照品溶液逐步稀释，当信噪比S/N≥3时确定为最低检测限。 (7)样品测定：在上述色谱条件下，测定10批河北产淡豆豉药材中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的含量。 结果： 1. 指纹图谱的建立： (1)提取：以70％乙醇超声提取2h，然后以AB-8大孔吸附树脂进行吸附，70％乙醇进行洗脱为佳，具有稳定和效率高等优点。 (2)色谱条件：色谱柱为Agilen HC-C18柱(250x4.6mm,5μm)；乙腈-3％冰乙酸为流动相进行梯度洗脱，流速为1.0ml/min，柱温为25℃，检测波长为261nm，进样量10μl。 (3)系统适用性试验：在此色谱条件下，染料木苷的保留时间约为21min，按染料木苷峰计算理论板数约为10万，与其它色谱峰的分离度大于1.0。 (4)稳定性试验：以染料木苷峰为内参比峰，计算各主要色谱峰相对保留时间及峰面积占总峰面积5％以上峰的相对峰面积值，其RSD分别为0.02％～1.06％和0.07％～1.30％，稳定性良好。 (5)精密度试验：各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5％以上峰的峰面积比值均无明显变化，其RSD分别为0.01％～0.58％和0.1％～2.21％，精密度良好。 (6)重复性试验：各主要色谱峰相对保留时间和峰面积占总峰面积5％以上峰的峰面积比值均无明显变化，其RSD分别为0.02％～0.53％和0.10％～2.02％，重复性良好。 (7)指纹图谱的建立：分别得到10批淫羊藿炮制淡豆豉、淡豆豉、黑豆原料的指纹图谱，并生成各药材对照指纹图谱。 (8)数据分析：运用相似度对所得数据进行分析，结果相似度均在0.99～1.00之间。 (9)炮制辅料图谱的建立：分别得到淫羊藿、青蒿、桑叶药材在已选定色谱条件下的图谱。 2. 总异黄酮成分的含量测定： (1)测定波长的确定：对照品溶液和供试品溶液均在263nm处有最大吸收，故确定263nm为测定波长。 (2)标准曲线的制备：以染料木素吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制吸收曲线，经回归处理得染料木素的标准曲线方程：Y=0.1393X+0.0466，相关系数为r=0.999(n=5)，通过回归方程可以看出，染料木素对照品浓度在1.590～5.566μg.ml-1。范围内，与吸收度呈良好的线性关系。 (3)稳定性试验：样品在48h内稳定，总异黄酮含量的RSD为1.00％。 (4)精密度试验：样品精密度良好，总异黄酮含量的RSD为0.10％。 (5)重复性试验：样品重复性良好，总异黄酮含量的RSD为0.73％。 (6)回收率试验：染料木素的平均回收率为100.70％，RSD为1.36％(n=9)。 (7)含量测定结果：淫羊藿炮制淡豆豉药材中总异黄酮的含量从2.6241～2.9907mg/g，平均含量为2.8187mg/g；淡豆豉药材中总异黄酮的含量从2.1323～2.7705mg/g，平均含量为2.4405mg/g：黑豆原料中总异黄酮的含量从2.1119～2.8398mg/g；平均含量为2.2357mg/g。 3. 四种大豆异黄酮成分的含量测定： (1)标准曲线的绘制：大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素分别在10.38～103.80μg、2.32～23.20μg、6.40～64.00μg、2.98～29.82μg范围内，呈良好的线性关系，回归方程分别为Y=26.059X±0.46，Y=35.181X±10.905，Y=89.756X-7.2494，Y=90.618X±57.825，相关系数均为r=0.9999(n=6)。 (2)稳定性试验：样品在48h内稳定，大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的RSD分别为1.00％、0.43％、0.46％和0.42％。 (3)精密度试验：样品的精密度良好，大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的RSD分别为1.59％、0.54％、1.24％和0.28％。 (4)重复性试验：样品的重复性好，大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素含量的RSD分别为2.36％、0.69％、1.51％和0.45％。 (5)回收率试验：大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的回收率分别为99.27％、98.32％、98.76％和99.03％，RSD分别为0.72％、1.32％、1.11％和0.80％。 (6)大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素的最低检测限分别为0.522ng、0.122ng、0.318ng和0.152ng。 (7)含量测定结果：河北产淡豆豉药材中大豆苷的含量从426.2～453.2μg/g，染料木苷的含量从376.1～401.3μg/g，大豆苷元的含量从247.6～263.8μg/g，染料木素的含量从135.4～149.61μg/g不等。 结论： 1. 建立了不同辅料炮制的淡豆豉中大豆异黄酮HPLC指纹图谱及UV含量测定方法，比较了不同辅料对淡豆豉炮制过程的影响，揭示了淡豆豉的炮制机理：炮制过程是多种成分综合作用的过程，总体上来讲是苷向苷元转化的过程。 2. 首次建立了淡豆豉样品中大豆苷、染料木苷、大豆苷元和染料木素多指标成分含量测定的HPLC法，方法稳定，重复性和精密度良好，为科学评价与有效控制河北产淡豆豉药材的质量提供了科学依据。 收起