摘要: 目的：研究RSV感染后TLR3的表达变化及其介导的下游信号分子改变，探讨TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的分子机制。用MT预先给药进行干预，通过比较TLR3的表达变化及其介导的下游信号分子改变，研究MT作用的机制；同时观察MT膜和核受体的表达，明确... 展开 目的：研究RSV感染后TLR3的表达变化及其介导的下游信号分子改变，探讨TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的分子机制。用MT预先给药进行干预，通过比较TLR3的表达变化及其介导的下游信号分子改变，研究MT作用的机制；同时观察MT膜和核受体的表达，明确MT是通过与何种受体的结合而发挥作用。方法：1.TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体外实验用RSV感染体外培养的RAW264.7细胞，收集不同感染时间点(设RSV感染0，l，4，8，16，24小时组)的细胞和培养上清，用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR.)检测TLR3、MyD88、TNF-a和iNOSmRNA的表达变化，用Westernblot检测TLR3蛋白和核内活性NF-kBp65蛋白的表达变化，用酶联免疫吸附试验(ELJSA)检测细胞培养上清中TNF-a蛋白变化。2.TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体内实验用RSV滴鼻感染昆明小鼠，收集不同感染时间点(设RSV感染0，1，4，8，16，24小时组或48，72，96小时组)的小鼠血清和肺，用半定量RT-PCR检测肺TLR3、MyD88、TNF-a和iNOSmRNA的表达变化，用Westernblot检测TLR3蛋白和核内活性NF.KBp65蛋白的表达变化，用ELISA检测小鼠血清中TNF-a表达变化。3.MT干预的体外实验MT分10-7M、lO-6M、10-5M三个浓度组，预先处理RAW264.7细胞，分别收集上述不同感染时间点的细胞和培养上清，用半定量RT-PCR检测TLR3、MyD88、TNF-a和iNOSmRNA的表达变化，并对MT膜受体MT1和MT2以及核受体RORa进行mRNA测定。用Westernblot检测TLR3蛋白和核内活性NF-kBp65蛋白的表达变化，用ELISA方法检测细胞培养上清中TNF-a蛋白变化。4.MT干预的体内实验MT分5mg·kg-1、10mg·kg-1、20mg·kg-1三个剂量组，预先灌胃给药，连续七天。分别收集上述不同感染时间点的小鼠血清和肺，用半定量RT-PCR检测肺TLR3、MyD88、TNF-a和iNOSmRNA的表达变化，并对MT膜受体MT1、MT2以及核受体RORa进行mRNA测定。用Westernblot检测TLR3蛋白和核内活性NF-KBp65蛋白的表达变化，用ELISA方法检测小鼠血清中TNF-a表达变化。结果：1.TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体外实验结果RSV感染4h后即上调RAW264.7细胞TLR3、TNF-a和iNOSmRNA的转录水平；RSV感染8h后即可诱导活化TLR3蛋白和核内活性NF-kB蛋白的表达，并升高细胞培养上清中TNF-a的分泌量。各指标的变化与对照组相比差异均有显著性，并且随着RSV感染时间的延长而表达量增加。但MyD88mRNA表达未见明显变化。2.TLR3介导RSV感染所致炎症免疫反应的体内实验结果RSV感染小鼠4h后即能上调肺TLR3mRNA的转录水平，诱导活化核内NF-kB蛋白的表达；RSV感染48h后上调TNF-amRNA的转录水平；感染72h上调iNOSmRNA的转录水平。并于RSV感染48h后观察到小鼠血清中TNF-a的分泌量也增加。各指标的变化较对照组差异均有显著性。但在感染24h内未检测到肺组织中TLR3蛋白的表达；而MyD88mRNA表达也未见明显变化。3.MT干预的体外实验结果MT三个浓度组(10-7M、10-6M、10-5M)在RSV感染RAW264.7细胞后4h，即可下调RSV诱导的TNF-amRNA的转录水平，其下调作用随着MT浓度的增加更加明显。而对于iNOSmRNA，10-7M的MT未能起到下调作用，10-6M和10-5M的MT则从RSV感染4h开始就能下调iNOS表达，10-5M的作用更明显。结果还显示：MT在10-7M浓度时未能起到下调NF-KB的作用，10-6M和10-5M浓度MT则从RSV感染4h开始就能下调其表达，10-5M的MT作用更明显。但各浓度组的MT对TLR3mRNA和蛋白的表达均没有明显的下调作用，而对MyD88mRNA表达也未见明显影响。对MT受体的检测结果显示，RAW细胞均未检测到膜受体MT1、MT2的表达，而核受体RORa在各组均有表达且均匀一致。MT在10-7M浓度时未能起到下调细胞培养上清TNF-a蛋白的作用，10-6M和10-5M浓度MT则从RSV感染8h开始就能下调其表达，其中10-5M的MT作用更明显。4.MT干预的体内实验结果MT在10mg·kg-1和20mg·kg-1剂量组时，均能在RSV感染72h后下调RSV诱导的肺组织TNF-a和iNOSmRNA的转录水平。20mg·kg-1剂量的MT组在RSV感染4h而10mg.kg-1剂量MT在RSV感染8h，即可下调NF-KB的活性表达。MT在10mg.kg-1。剂量时，从RSV感染的48h开始可降低血清中TNF-a的产生，其中20mg·kg-1剂量的下调作用更明显。但各剂量组的MT对TLR3、MyD88和RORa的表达均不影响。我们也未检测到MT1、MT2的表达。结论：1.RSV感染可上调TLR3、TNF-a和iNOSmRNA的表达，诱导活化TLR3蛋白和核内NF-kB的表达，升高细胞培养上清和小鼠血清中TNF-a的分泌量。表明病毒诱导的炎症免疫反应与TLR3活化的信号转导途径有关，TLR3可能参与了RSV诱导的炎症免疫反应，推测是通过MyD88非依赖或部分依赖途径而活化NF-kB。2.MT在一定浓度和剂量范围内，能降低RSV诱导的RAW264.7细胞和肺的核内活性NF-kB的表达，下调RSV诱导的TNF-a和iNOSmRNA的转录水平，降低细胞培养上清和小鼠血清中TNF-a的分泌量。但MT对TLR3mRNA和蛋白，MyD88和RORa的mRNA表达均无明显影响。3.MT抑制RSV诱导的NF-KB活化、下调TNF-a和iNOS的表达随着药物剂量(或浓度)的增加及感染时间的延长而更加明显。4.MT可能通过与其核受体结合，抑制NF-kB活化，发挥抗RSV感染所致的炎症反应。5.在RSV感染所致炎症免疫反应中，MT可能对TLR3、MyD88等上游信号分子无抑制作用。 收起