摘要: 第一部分大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养和鉴定 目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法。 方法: V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织，并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织，然后培养于含10％胎牛血清的RPMI... 展开 第一部分大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养和鉴定 目的:建立成年大鼠胰腺导管干细胞的体外分离、培养及鉴定的方法。 方法: V型胶原酶溶液灌注消化成年大鼠胰腺组织，并经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织，然后培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液，而后加入EGF(表皮生长因子)和bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)继续培养，7天可形成单层细胞，用0.25％胰酶-EDTA消化并传代培养。取第2代细胞利用免疫荧光染色和RT-PCR方法检测CKl9、Pdx-1、Nestin、insulin及glucagon的表达。 结果:经胶原酶灌注消化胰腺导管上皮，再经过Ficoll密度梯度离心去除胰岛组织，可使胰腺导管细胞得到较好的纯化。免疫荧光结果示胰腺导管细胞CKl9、Pdx-1和Nestin染色呈阳性，阳性细胞率分别为(88.6±6.2)％，(84.6±8.6)％，(79.3±10.5)％，而insulin及glucagon染色为阴性。RT-PCR结果显示该细胞表达CK19、Pdx-1和Nestin基因。 结论:该方法可较好的分离出胰腺导管细胞，经鉴定该法培养所获细胞具有胰腺干细胞的特性。 第二部分应用INGAP体外诱导胰腺导管干细胞向胰岛D细胞分化 目的:建立体外诱导胰腺干细胞分化为胰岛素分泌细胞的方法，应用胰岛新生相关蛋白(INGAP)建立新的诱导分化体系，实现体外胰岛新生。 方法:体外分离培养SD大鼠胰腺导管干细胞，选取第2～6代干细胞进行分步诱导分化，并于分化后期进行分组培养，INGAP组加入INGAP多肽，而对照多肽组加入对照多肽，诱导结束后收获两组新生类胰岛样细胞团(ILCs)分别行免疫荧光染色和RT-PCR检测insulin和glugagon的表达，并通过葡萄糖刺激的胰岛素释放试验(GSIS)评价新生ILCs的胰岛素分泌能力。 结果:第2～6代胰腺导管干细胞经过体外四步诱导分化，INGAP组和对照多肽组均可形成ILCs，免疫荧光染色结果显示ILCs insulin和glucagon染色均为阳性，RT-PCR检测结果也证明INGAP组和对照多肽组ILCs均有insulin和glucagon基因的表达，其中insulin基因的相对表达量INGAP组为0.324±0.09，对照多肽组为0.102±0.04，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)；glucagon基因的相对表达量INGAP组为0.260±0.05，对照多肽组为0.085±0.04，两组比较差异有统计学意义(P<0.01)，而INGAP组insulin和glucagon相对表达量与正常胰岛比差异均无统计学意义。新生ILCs在低糖和高糖刺激下的刺激指数INGAP组为(3.3±0.1)，对照多肽组为(2.6±0.4)，正常胰岛为(3.1±0.4)；低糖和高糖刺激下胰岛素分泌量INGAP组与对照多肽组相比有明显增多(P<0.01)。 结论:通过建立的新的包含INGAP多肽的诱导分化体系可以获得具有胰岛素分泌功能的新生类胰岛样细胞团，为胰岛移植来源提供了新的更有效的途径。 收起