摘要: 将外源基因克隆在杆状病毒的穿梭载体上，然后转化E.coli DH10B感受态细胞并且提取质粒，与含有Bacmid的感受态细胞发生转座，在含Kanr/Tetr/X-gal/IPTG的LB固体平板上挑取白色单菌落，提取大质粒，在质脂体的作用下感染Sf-21细胞，通过荧光显微镜的观... 展开 将外源基因克隆在杆状病毒的穿梭载体上，然后转化E.coli DH10B感受态细胞并且提取质粒，与含有Bacmid的感受态细胞发生转座，在含Kanr/Tetr/X-gal/IPTG的LB固体平板上挑取白色单菌落，提取大质粒，在质脂体的作用下感染Sf-21细胞，通过荧光显微镜的观察可以知道基因的表达情况，此方法即是所说的Bac to Bac表达系统，同时此方法广泛的应用在病毒、真菌、植物和动物的相关基因表达。其中武汉大学的刘鑫博士利用Bacmid-egfp穿梭载体成功地表达了麻疹病毒受体SLAM，以绿色荧光作标记发现表达的SLAM蛋白定位在Sf-9细胞表面，与人类细胞中的自然定位相同。而且Sf-9细胞表面的SIAM可以介导麻疹病毒对非受纳昆虫细胞的感染。证明该系统维持了亲本Bac to Bac系统的特性和功能，但却增加了亲本Bacmid所不具我们利用两个Bac to Bac系统，即基于AcMNPV的Bac to Bac系统(AcBacmid)和带绿色荧光蛋白基因标记的AcMNPV Bac to Bac系统(AcBacmid-egfp)，通过位点特异性转座，将AcMNPV多角体蛋白基因ph-ph和异源Mcherry和IRES基因转座到两个不同的Bacmid基因组中，再转染昆虫细胞，构建了三种重组穿梭载体：pFBDM-ph-ph，pFBDM-Mcherry和pFastBac1-IE2-red-IRES-egfp。 三种重组穿梭载体分别感染Sf-21细胞，4-5天后，其中将多角体蛋白基因和绿色荧光蛋白基因的融合表达盒经Bac to Bac系统转座载体的位点特异性转座，转到Bacmid基因组上，构建成多角体蛋白与绿色荧光蛋白融合的重组穿梭载体Bac-ph-ph/gfp，将阳性的Bac-ph-ph/gfp DNA转染Sf-21细胞后包装成重组病毒vAc-ph-ph/gfp，ph-ph/EGFP融合蛋白能够正常表达，在荧光显微镜下观察可以发现绿色荧光及病毒包涵体，而且绿色荧光只在包涵体颗粒的表面产生，细胞质及细胞核的其它地方没有绿色荧光，这说明绿色荧光蛋白通过与多角体蛋白融合能成功地展示到病毒包涵体的表面。同时与对照pFBDM-ph相比包涵体产生数量比较多，大小不均形状也不规则。pFBDM-Mcherry和pFastBac1-IE2-red-IRES-egfp所感染的细胞不仅有绿色荧光而且有红色荧光出现，表明了Mcherry和IRES基因在昆虫细胞里表达。同时用pFBDM-ph-ph和pFBDM-Mcherry感染的上清液混合二次感染Sf-21细胞，红色荧光融合在病毒包涵体之中，表明异源的Mcherry蛋白能够装配到重组病毒pFBDM-ph-ph的ODV的囊膜上。 最后我们利用同源重组构建的一种细胞壁合成缺陷型的大肠杆菌DHIOB-asd，asd是编码二氨基庚二酸的基因，是细胞壁的重要组成。由于asd基因的缺失，所以必须在培养基中加DAP(二氨基庚二酸)细菌才能合成细胞壁，pGB2-inv质粒含有inv基因，可以表达侵染蛋白。我们在这里转化pGB2-inv质粒进入大肠杆菌DH10B-asd-，然后电转pFBDM-ph-ph-AcBacmid-gfp进入大肠杆菌DH10B-asd，构建菌株DH10B-asd-inv-PFBDM-ph-ph-Acbacmid-egfp，我们将细菌菌液与昆虫细胞Sf21直接混合。在inv侵染蛋白的介导下，大肠杆菌通过细胞表面受体介导的内吞作用进入细胞，在缺乏DAP的情况下，细菌不能合成细胞壁，裂解。pFBDM-ph-ph-AcBacmid-gfp释放出来，复制、装配、表达gfP绿色荧光蛋白，同时里面有包涵体存在。 收起