摘要: 水稻条纹叶枯病(RiceStripeDisease)是由水稻条纹病毒(RiceStripeVirus，RSV)引起的一种危害严重的水稻病毒病，通过灰飞虱刺吸以持久方式传播。该病害在我国最早发生于1963年。从上世纪90年代末开始，由于粳稻品种种植面积不断扩大，再加上种植制度改... 展开 水稻条纹叶枯病(RiceStripeDisease)是由水稻条纹病毒(RiceStripeVirus，RSV)引起的一种危害严重的水稻病毒病，通过灰飞虱刺吸以持久方式传播。该病害在我国最早发生于1963年。从上世纪90年代末开始，由于粳稻品种种植面积不断扩大，再加上种植制度改变和暖冬年份连续出现等因素，使得一度沉寂的水稻条纹叶枯病在江苏等地区又开始普遍发生，造成水稻大面积减产。过去对该病害的防治实践表明，只有培育和使用抗耐病品种才是防治该病最经济有效的途径。而目前使用的抗病品种抗源基础比较狭窄，主要是利用来自巴基斯坦籼稻Modan中的抗病基因Stv-bi，所以为了改变长期依靠单个基因抗性的现状，寻找新的抗病基因、培育优良抗病新品种成为当前防治水稻条纹叶枯病的首要任务。目前主要是通过传统的杂交育种来选育抗病新品种，但效率较低而且抗病鉴定也比较困难，而利用现代的基因工程技术来快速改良高产优质但感病的水稻品种则具有广阔的应用前景。所以本研究围绕条纹叶枯病抗性育种开展了两个方面的研究：一是寻找并定位新的抗病基因；二是利用新的基因工程技术来培育转基因抗病水稻。目前取得的研究结果如下：1、利用抗病亲本籼稻Dular和感病亲本粳稻Balilla杂交构建的F2无性系群体，在2004和2005年，采用人工接虫传毒试验，分别以株系发病率和病级指数两个指标为表型值，鉴定两个亲本和226个F2无性系对RSV的抗性。利用WindowsQTLCartographer2.0定位软件对RSV的抗性基因进行检测。以株系发病率为表型值共检测到3个QTLs，分别命名为qSTV-3、qSTV-11b、qSTV-11c。qSTV-3位于3号染色体标记区间RM7324-RM3586，qSTV-11b和qSTV-11c位于11号染色体上两个相邻区间RM287-RM209和RM209-RM21。两年重复试验定位的QTLs位置相同，但三个QTLs的LOD值和贡献率在年度间有差异。在2004年，3个QTLs的LOD值分别为3.08、26.81、22.89，贡献率分别为4.5％、46.73％、41.09％；2005年3个QTLs的LOD值分别为2.51、14.53、13.50，贡献率分别为3.73％、31.62％、26.21％。以病级指数为表型值也检测到3个QTLs，分别命名为qSTV-11a、qSTV-11b、qSTV-11c。3个QTLs都位于第11染色体上，分别位于标记区间RM1124-SSR20、RM287-RM209和RM209-RM21。两年重复试验QTLs位置一致。2004年3个QTLs的LOD值和贡献率分别为7.51、11.58、8.40和28.69％、30.27％、25.41％；2005年3个QTLs的LOD值和贡献率分别为7.22、11.34、10.42和46.48％、22.82％、20.1％。所有检测到的QTLs均来自抗病亲本籼稻品种Dular。对QTL定位分析可以看出，位于RM287-RM209和RM209-RM21间的qSTV-11b、qSTV-11c在两种表型值下都被检测到，且联合效应较高，经与Stv-bi位置比较，可以认为其中一个是新的抗病基因。 2、为了进一步确定这两个连锁抗病基因的染色体位置，利用F3群体和回交群体对它们进行了精细定位。首先根据http//上公布的序列在RM287-RM21之间合成了一些新的引物，最后得到6对多态性标记。使用8个多态SSR标记RM287、RM7275、RM5960、RM5312、RM1355、RM209、RM6897、RM5349、RM21对部分典型感病植株进行了分子检测。结果发现在RM287与RM21之间存在两个交换断点，说明在RM287与RM21之间确实存在两个抗病位点。连锁分析显示，一个交换断点发生在RM1355与RM209之间，与RM1355和RM209的遗传距离分别为0.6cM和2.3cM；另一个交换断点发生在RM6897与RM5349之间，与RM6897、RM5349的遗传距离分别为2.8cM和1.1cM。在用这些标记对感病植株进行分子检测时还发现在交换株中都只存在一个交换断点，即感病植株在其中一个交换点一侧呈现纯合感病亲本带型，另一侧包括另外一个交换点呈现杂合带型或纯合抗病亲本带型。这些分子检测结果暗示了这两个抗病位点是通过互作产生抗性的，即在两个抗病位点处只要有一个位点呈现纯合感病亲本带型，则该植株就表现为感病症状。接着利用水稻DNA多态性数据库中的关于Insertion/Deletions(InDels)的信息，设计新的STS分子标记用于进一步的定位。用6对多态STS标记对感病交换株的检测结果表明，qSTV-11b位于标记RM1355与STS11-31之间，与RM1355和STS11-31的遗传距离分别为0.6cM、0.4cM；qSTV-11c位于标记STS11-19与RM5349之间，与STS11-19和RM5349的遗传距离分别为0.9cM、1.1cM。从http//上公布的水稻物理图谱我们可以发现，RM1355所在的克隆AC135569与STS11-31所在的克隆AC136009之间还相隔两个克隆AC124151和AC150202，两标记间相距大约269.6kb，STS11-19所在的克隆AC135568与RM5349所在的克隆AC134925之间也相隔两个克隆AC134256和AC133248，两标记间相距大约440.1kb。 3、分别利用条纹叶枯病毒的外壳蛋白(coatprotein，CP)和病害特异性蛋白(disease-specificprotein，SP)基因序列构建了包含该基因反向重复序列结构的RNA干扰表达载体，通过农杆菌介导转化两个粳稻品种成熟胚获得了转基因水稻植株。检测结果表明获得82株转CP基因水稻幼苗，其中苏御糯转基因苗30株，3015转基因苗52株；转SP基因获得的转基因苗有89株，其中苏御糯转基因苗37株，3015转基因苗52株。在对转基因苗进行接虫鉴定抗性前对SP转基因苗提取mRNA，以S1与S2为引物对所提mRNA进行RT-PCR扩增，结果显示在转SP基因植株中SP基因已经转录。然后对所有的转基因植株进行接虫传毒试验，待病情稳定后调查抗性，结果显示在转CP基因植株中，苏御糯得到的5个转化子，4个表现抗病，其中1个达到免疫，3015得到的8个转化子，7个表现抗病，其中4个达到免疫；转SP基因植株中，苏御糯得到的5个转化子，4个表现抗病，其中1个达到免疫，3015得到的7个转化子，6个表现抗病，其中4个达到免疫。再对接种后的转基因植株进行RT-PCR分析，结果表明病毒RNA并没有得到明显的积累，说明转基因水稻体内由于病毒基因反向重复序列转录产生了发夹结构的双链RNA，在病毒RNA侵染后诱导了双链RNA介导的依赖同源序列的RNA降解，即发生了转录后基因沉默。选择4个转化子的后代进行了转基因的分离检测结果表明在这4个转化子中，目的基因以单拷贝形式整合到水稻基因组中。 收起