摘要: 本研究中，我们以杜氏盐藻为材料进行了MAR的分离与功能性研究。首先用二碘水杨酸锂盐(LIS)抽提杜氏盐藻细胞核制备了盐藻核基质，限制酶充分消化，SDS-蛋白酶K提取杜氏盐藻核基质结合区DNA，连接至pUC18载体上构建了杜氏盐藻随机MAR文库，蓝白斑筛选... 展开 本研究中，我们以杜氏盐藻为材料进行了MAR的分离与功能性研究。首先用二碘水杨酸锂盐(LIS)抽提杜氏盐藻细胞核制备了盐藻核基质，限制酶充分消化，SDS-蛋白酶K提取杜氏盐藻核基质结合区DNA，连接至pUC18载体上构建了杜氏盐藻随机MAR文库，蓝白斑筛选出56个阳性菌落。体外结合实验筛选从构建的杜氏盐藻随机MAR文库中筛选出3个能与核基质结合的DNA片段，其中2个片段结合能力较强。测序分析3个DNA片段具有典型的MAR特征，富含AT，具备A-box，T-box等一些典型的特征。将分离的MAR片段作为调控元件构建到包含氯霉素乙酰转移酶报告基因(CAT)表达载体pRNC表达盒的两侧，与含bar基因的表达载体pSP-B1电击共转化杜氏盐藻细胞，草丁膦(PPT)进行抗性筛选，获得了稳定转化的杜氏盐藻藻株。采用ELISA方法检测报告基因CAT酶活性，结果证实分离的3个MAR片段能分别提高报告基因CAT酶活性1.5倍，4.5倍及2.2倍。Southernblotting证实转化的CAT基因已经整合到转化的杜氏盐藻基因组DNA上。Northernblotting分析证实CAT报告基因能在RNA水平进行转录与表达。 结论：1、首次从单细胞的杜氏盐藻中分离出了3个MAR片段，其特征符合一般生物MAR的基本特征。如富含AT、具备一些特征性基序。2、CAT报告基因能在杜氏盐藻中表达。3、分离的MAR能提高报告基因CAT在稳定转化杜氏盐藻中的表达水平。4、MAR的促进效应与其在体外与核基质的结合能力并不呈相关性。5、含MAR表达载体转化的杜氏盐藻CAT基因已经稳定整合到转化杜氏藻株的基因组中。6、含MAR表达载体转化的杜氏盐藻CAT基因能在RNA水平正常转录和表达。 收起