摘要: 杜氏盐藻(Dunaliella Salina D.salina)为一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,是迄今为止所发现世界上最耐盐的植物之一,其抗逆力极强,能在0.05M-5MNaCl的环境中生存.热休克蛋白(hsp)70家族是目前已知的最保守的蛋白家族之一.在绿色植物和藻类,不同hsp70基... 展开 杜氏盐藻(Dunaliella Salina D.salina)为一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,是迄今为止所发现世界上最耐盐的植物之一,其抗逆力极强,能在0.05M-5MNaCl的环境中生存.热休克蛋白(hsp)70家族是目前已知的最保守的蛋白家族之一.在绿色植物和藻类,不同hsp70基因的编码产物分布在胞浆、叶绿体和线粒体内,参与新生蛋白质的正确折叠、转运及其降解,对细胞的生长、分化和各种环境的适应都起着重要作用.光和热胁迫均可诱导生成大量的hsp70 mRNA.因此,作为诱导表达产物,其hsp70基因启动子已经被用于构建转基因莱茵衣藻表达载体,并得到了成功的转化.该研究根据hsp70在各物种间高度保守这一特点,克隆得到定位在胞浆的杜氏盐藻hsp70基因组DNA全长以及其两侧调控序列,并初步探讨hsp70 mRNA表达水平以及与光和热诱导的关系,为下一步杜氏盐藻表达载体的构建奠定基础.结论1.PPT对pDSBAR转化野生型杜氏盐藻的成功筛选,提示bar基因可能作为转基因杜氏盐藻的主要筛选标记基因.2.克隆得到杜氏盐藻胞浆定位的hsp70基因组DNA序列及其两侧调控序列,其中5'侧调控序列中包含有2个热休克元件.杜氏盐藻hsp70 mRNA水平增高与光、温度诱导均有关系,因此,该基因启动子的克隆为诱导型转基因杜氏盐藻表达载体的构建奠定了基础.该编码基因中GC/AT比值增高,密码子有显著的偏爱性,提示待转化的外源基因也应该具有相似的密码子偏爱.3.克隆得到杜氏盐藻肌动蛋白基因两侧调控序列,该基因5'侧调控序列中包含有一个75bp长的序列重复,提示可能与该基因启动子的活性有关.肌动蛋白基因在杜氏盐藻中成单拷贝形式存在.4.利用氨基酸高度同源区域设计简并引物,通过PCR从cDNA文库中筛选同类基因,是获得基因家族成员常用的分子生物学方法.简并引物对选定扩增区氨基酸简并程度越低越好,但是引物的3'端不应存在简并.PCR时简并引物的浓度提高到5M,高于常规PCR的5~50倍(0.1~1M),复性温度可以提高到50~55℃. 收起