摘要: 14-3-3蛋白普遍存在于所有真核生物细胞中，它具有高度保守性，但又是功能复杂的同源或异源二聚体分子。1967年，Moore和Perez首次在牛脑细胞中发现一种酸性、可溶的异源二聚体蛋白，并根据它们在DEAE-纤维素色谱上的组分数以及在淀粉凝胶中的迁移率命... 展开 14-3-3蛋白普遍存在于所有真核生物细胞中，它具有高度保守性，但又是功能复杂的同源或异源二聚体分子。1967年，Moore和Perez首次在牛脑细胞中发现一种酸性、可溶的异源二聚体蛋白，并根据它们在DEAE-纤维素色谱上的组分数以及在淀粉凝胶中的迁移率命名为14-3-3，其大小约为25-32KD，等电点为4-5。现已清楚它广泛分布于从植物到哺乳类的真核细胞内。研究表明，14-3-3蛋白是一个调节蛋白家族，与癌基因或原癌基因产物结合参与细胞信号传导，并能与许多功能不同的信号蛋白结合，例如蛋白激酶Raf-1、KSR-1、Bcr、Ca2+/钙调蛋白激酶、PKC、蛋白磷酸酶cdc25c、促凋亡蛋白BAD、抗凋亡蛋白A20、跨膜蛋白受体GA等。因此它参与细胞许多重要的生理过程，并在其中起着至关重要的作用，如细胞信号的转导、细胞周期的调控、细胞的凋亡、免疫应答、恶性肿瘤的形成等。 因此，无论是对细胞信号转导、神经科学、肿瘤发病机制，还是在植物生理机制及其对外界胁迫的反应，对它的研究都具有重要意义。此外，近来已有研究证实14-3-3蛋白通常具有阻止细胞凋亡的作用，在肿瘤细胞中表达抑制14-3-3与其他蛋白之间相互作用的多肽可以诱导肿瘤细胞凋亡。而干扰14-3-3功能可能引起细胞快速增殖并增强细胞对凋亡的敏感性，由此提高传统抗癌药物的疗效，靶向14-3-3蛋白也有望为治疗肿瘤开辟一个新途径。 杜氏盐藻(Dunaliellasalina)归属于绿藻门，绿藻纲，团藻目，杜氏藻科。是一种比较独特的单细胞绿藻，无细胞壁，含有一个大的“杯状”叶绿体，能进行光合作用，具有鞭毛，能游动，可在0.05-5Mol/LNaCL培养液中生长，抗逆性极佳，是一种较为理想的抗逆境生存的生物，也是作为遗传学研究的良好材料。并且用它作为生物反应器生产口服型疫苗或其他药物，无须纯化即可直接服用，大大降低生产成本。 选择一些具有特征性的生物作为模式生物，研究高等生物复杂生命现象是生命科学研究的一种重要方法。目前已有多种生物被选做模式生物，如果蝇、酵母、线虫等都是典型的模式生物。藻类生物中莱茵衣藻也是一种很好的模式生物，杜氏盐藻和衣藻同属于绿藻门团藻目，亲缘关系相近，并且盐藻还具有一些独特的生物学特性。因此以盐藻作为模式生物来研究14-3-3蛋白的功能及调控机制可能更具有特点和优势。目前关于14-3-3蛋白及其基因的研究已在许多生物中开展，但以盐藻作为材料的还未见报道。本研究旨在克隆盐藻14-3-3蛋白基因，进而研究其在细胞信号传导、细胞凋亡等生命现象中的作用机制。也为调控盐藻细胞的生长、建立盐藻生物反应器鉴定了基础。 本研究首先以简并引物PCR的方法克隆了杜氏盐藻14-3-3基因部分cDNA序列。根据此cDNA片段序列信息，利用RACE(RapidamplificationofcDNAends，cDNA末端快速扩增)法分别向该基因的5'上游和3'下游进行扩增，获得了杜氏盐藻14-3-3基因的5'和3'两端序列。将上述各序列拼接设计引物，RT-PCR得到了杜氏盐藻14-3-3基因的全长序列。为研究14-3-3蛋白的功能和机制奠定了坚实的基础。 一、杜氏盐藻14-3-3基因cDNA片段的克隆与分析1实验方法利用简并引物扩增杜氏盐藻14-3-3基因cDNA片段根据GenBank上不同物种的14-3-3蛋白氨基酸序列，找出14-3-3蛋白的氨基酸高度保守同时核苷酸简并程度低的序列设计简并引物。以杜氏盐藻总RNA为模板，用AMV反转录酶合成cDNA第一链，再以此为模板，PCR扩增14-3-3基因的cDNA片段。RT-PCR产物利用T-A克隆方法，亚克隆到载体pMD18-T上，随机挑选阳性克隆进行测序。测序结果与GenBank上其他物种的14-3-3基因序列进行比对分析，并用BLAST进行同源性分析。 2实验结果测序结果分析表明，RT-PCR得到的14-3-3cDNA片段长为531个碱基，由其推导出的氨基酸序列包含177个氨基酸残基。经BLAST分析证明，与数据库中其他物种的14-3-3氨基酸序列有很高的同源性，其中与衣藻的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为94％，与烟草的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为84％，与豌豆的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为84％，拟南芥的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为83％，与西红柿的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为83％，与人的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为80％，由此可以判断扩增的片段为杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA基因部分序列。 二、杜氏盐藻14-3-3基因全长cDNA序列的克隆及序列分析1实验方法1.15'RACE的方法扩增14-3-3基因5'上游cDNA片段提取杜氏盐藻细胞的总RNA，根据上述简并引物扩增出的杜氏盐藻14-3-3基因部分cDNA片段序列信息，利用5'RACE的方法向5'上游区扩增杜氏盐藻14-3-3基因的5'cDNA末端片段。本实验利用5'-fullRACE试剂盒，将反转录产物环化(self-ligation)后，再利用基因特异引物分别进行巢式PCR。扩增结果即为包含部分已知序列的杜氏盐藻14-3-3蛋白基因的5'上游未知序列片段。扩增产物亚克隆到载体pMD18-T上，转化大肠杆菌JM109，对经过筛选和鉴定正确的质粒进行序列分析。 1.23'RACE的方法扩增14-3-3基因3'下游cDNA片段提取杜氏盐藻细胞的总RNA，根据上述简并引物扩增出的杜氏盐藻14-3-3基因部分cDNA片段序列信息，利用3'RACE的方法向3'下游区扩增杜氏盐藻14-3-3基因的3'cDNA末端片段。利用3'-fullRACE试剂盒，用oligodTAdaptorPrimer逆转录mRNA得到第一条cDNA链，然后利用根据已知序列设计的基因特异引物1和接头引物进行第一轮PCR扩增，为了增加特异性，再利用基因特异引物2和接头引物进行第二轮PCR扩增。扩增结果即为包含部分已知序列的3'端的未知序列片段。扩增产物利用T-A克隆方法，亚克隆到载体pMD18-T上，随机挑选阳性克隆进行测序。 1.314-3-3基因全长cDNA序列的克隆及序列分析将已经得到的14-3-3三段序列拼接，重新设计引物，利用RT-PCR的方法，得到杜氏盐藻的14-3-3全长cDNA序列。 分别使用Dnaman软件、Dnasis软件以及GenBankBLAST检索分析系统等对所扩增的14-3-3基因全长进行氨基酸和核苷酸序列同源性以及密码子偏好性等的分析。 2实验结果2.15'RACE的方法扩增14-3-3基因5'上游cDNA片段根据已知的14-3-3部分序列信息，利用5'RACE的方法扩增14-3-3基因的5'上游序列，得到一个约260bp的序列，除去非编码区序列，推导出的氨基酸序列共有58个氨基酸残基。序列中含有起始密码子ATG。根据BLAST分析结果，显示该氨基酸序列与其它物种14-3-3蛋白基因氨基酸序列有较高的同源性。 2.23'RACE的方法扩增14-3-3基因3'下游cDNA片段根据已知的14-3-3部分序列信息，利用3'RACE的方法扩增14-3-3基因的3'上游序列，得到一个约750bp的序列，除去非编码区序列，推导出的氨基酸序列共有41个氨基酸残基。序列中含有终止密码子TAA和poly(A)尾。根据BLAST分析结果，显示该氨基酸序列与其它物种14-3-3蛋白基因氨基酸序列有较高的同源性。 2.314-3-3基因全长cDNA序列的克隆及序列分析测序结果分析表明，得到了14-3-3蛋白的全长cDNA序列(该序列已在GenBank登录，基因序列号为：AY965896)。它是一个1485bp的序列，含有一个完整的开放读码框，全长编码区共774bp，推导的氨基酸序列有258个氨基酸残基。在将该氨基酸序列与GenBank已知物种的14-3-3氨基酸序列进行BLAST分析、比较后，显示该氨基酸序列与其它物种14-3-3蛋白基因氨基酸序列有较高的同源性。 三、结论；1-克隆得到完整的14-3-3cDNA序列，全长1485bp，包含一个完全的开放读码框(774bp)，编码一个全长258个氨基酸的蛋白序列，该序列与Chlamydomonasreinhardtii(衣藻)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为89％，与Nicotianatabacum(烟草)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为81％，Arabidopsisthaliana(拟南芥)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为80％，与tomato(西红柿)的14-3-3蛋白基因氨基酸序列同源性为77％，与Homosapiens(人)的14-3-3蛋白基因同源性为80％。 2.对杜氏盐藻14-3-3密码子使用偏好性的分析结果提示，在杜氏盐藻14-3-3氨基酸序列中，具有两种以上同义密码子的氨基酸偏好使用以C/G为结尾的密码子，其中CCC、CGC、GCC、GGC、GGG等高G+C含量的密码子使用频率较高，而低G+C含量的密码子使用频率较低。 收起