摘要: 本研究分为二部分： 第一部分:先天性巨结肠RETT基因和PHox2B基因多态性研究 先天性巨结肠(Hirschspnmg's diseaSe,HD),是小儿外科常见疾病,在高加索人,非洲黑人、亚洲黄种人的发病率分别为万分之1.5、2.1、2.8,亚洲人种发病率最高.HD是一种神经... 展开 本研究分为二部分： 第一部分:先天性巨结肠RETT基因和PHox2B基因多态性研究 先天性巨结肠(Hirschspnmg's diseaSe,HD),是小儿外科常见疾病,在高加索人,非洲黑人、亚洲黄种人的发病率分别为万分之1.5、2.1、2.8,亚洲人种发病率最高.HD是一种神经嵴源性疾病,当胚胎发育过程中神经嵴细胞迁徙、分化发生停顿或发生细胞凋亡,均会导致远端肠管的神经支配异常而导致HD.近年来通过遗传连锁分析和基因敲除等技术,发现有以下基因的突变与HD的发病有关:编码有关酪氨酸激酶通路基因(包括RET原癌基因,GDNF基因,GFRα-1基因等),编码血管内皮素信号通路的基因(包括EDNRB基因,EDN3基因和ECE-1基因),编码转录因子的基因(如SOX10基因和PHOx2B基因)等.其中RET基因表达对肠神经元细胞的发育十分关键,在HD的发病中最为重要.但对HD进行大量RET基因突变研究发现,仅有20%左右的散发性和50%左右家族性HD存在突变,而且缺乏类似肿瘤相关的热点突变,另外HD相关RET突变有不完全外显(incomplete penetrance),呈突变效应性别相关性.更为重要的是,在家族性病例,遗传连锁分析定位遗传位点在10q 11.2,却仍缺乏RET编码区突变.随着SNPs疾病相关性研究的进展,对HD的砌汀基因研究重点逐渐转移到多态性的研究上.尚未证实单个sNPs导致HD相关RET功能改变,但可能有精确的SNPs组合(单倍型)决定调节意义.在高加索人种,发现有数个RET编码区sNPs与散发性HD相关:A45A(c135G>A;exon 2)和L769L(c2307T>G;exon 13).对RET基因启动子的研究发现,在RET编码序列上游的启动子的两种多态性-5G>A和-A>C与HD相关.目前对RET 基因的研究,均局限于编码区的突变及SNPs研究,虽然也有少量非编码区(内含子和启动子)的研究,但缺乏相应的功能研究. 本课题拟通过对浙江汉族人群HD患者和正常人群的对照研究,分析RET基因和PHOX2B基因SNPs与HD发病之间的关系,不同类型HD与基因SNPs关系,进一步推断主要的HD相关单倍型,并对照其他种族人群已有数据,分析浙江汉族人群的SNPs分布特点.同时应用免疫组化法,检测RET 基因启动子多态性与RET蛋白表达之间的关系. 材料和方法 1.病例收集及标准 (1)病例组:全部病例均为本院的浙江籍先天性巨结肠患儿,共123例.根据2005年第四届国际巨结肠与相关神经嵴源性疾病会议的巨结肠诊断标准,重新阅片确定. (2)分组及标准:将巨结肠分为短段型与长段型两种. 短段型HD:病变仅局限于乙状结肠远端,乙状结肠直肠交界及直肠. 长段型HD:病变范围包括乙状结肠近端,升结肠及累及范围更广者. (3)正常对照组:全部正常对照组均来自本院正常体检小儿,排除消化道和神经嵴相关畸形,共194例.全部病例及对照组抽取外周血2ml,3.8%枸橼酸钠抗凝.本研究经浙江大学医学院附属儿童医院伦理委员会批准,全部患儿及对照组均获得家长知情同意. 2.PCR反应及测序 对全部样本进行DNA提取后,根据选取的SNPs,合成引物,PCR扩增,经2%琼脂糖.电泳证实PCR产物后,将PCR产物进一步纯化、测序. 3.免疫组化根据RET启动子多态性,分别选取相应患儿病理组织切片,观察神经元,确定含正常神经元蜡块,再行C-Pet免疫组化染色,将该切片镜下所有神经元按免疫组化反应等级均予计数. 4.统计方法 (1)用Hardy-Weinberg平衡定律来检验样本人群中基因频率与基因型频率是否平衡. (2)基因和疾病的相关性分析:使用X2方检验(Chi squared),相关性以比值比(odds ratios,ORs)及其95%可信区间(confidence intervals,CIs)表示,以P值<0.05确定为统计学差异有显著性. (3)单倍型频率用PHASE软件计算. (4)免疫组化结果用非参数统计中的两样本等级和检验(Mann-Whimev Test). 结论 1.RET基因-5G>A,-1A>C,c135G>A,c2307T>G四个位点多态性与浙江汉族人群HD明显相关,但与HD类型无明显相关. 2.RET基因-5G>A,-1A>C,c135G>A,c2307T>G四个位点单倍型ACAG是浙江汉族人群的HD相关核心单倍型. 3.浙江汉族人群的RET基因-5、c135和c2307位点的少见等位基因频率较其他人种有明显增高. 4.RET启动子多态性对启动子功能有影响,与RET蛋白表达相关. 5.未发现PHOX2B基因多态性与浙江汉族人群HD相关. 第二部分：肠神经元发育不良病理特点及与EC关系研究 近年来逐渐认识到一类临床表现与HD十分相似,但病理改变与HD明显不同的疾病,称之为巨结肠同源病 (allied disorders of Hirschsprung's disease;ADHD),主要包括肠神经元发育不良(Intestinal neuronal dysplasia;IND)、神经节细胞减少症 (Hypoganglionosis)、神经节细胞未成熟症 (Immaturity of ganglion cells) 等. 对IND的手术指征和切除标准仍不确定,大部分的单纯型IND可以根据病情适当的保守治疗(如改变饮食结构,应用缓泻剂等)和临床观察,随生长发育部分患儿不手术也可以自行好转甚至自愈,在一定条件下(如肠造瘘).IND病变可以自行再发育为成熟的神经元细胞而恢复功能.但对严重腹胀,小肠结肠炎患儿仍需及时手术治疗,局限型IND,可以将病变肠段全部切除,以达到较好的手术效果;而对广泛性病变,仍缺乏切除范围的明确标准,可先行回肠造瘘术,营养情况改善后再行进一步根治术,有报道切除小部分病变结肠到全部结肠(甚至部分小肠).临床常见部分患儿巨结肠术后恢复良好,而部分患儿术后一段时间内仍有反复EC,甚至需要再次肠造瘘.术后EC是否与伴发IND病变有关?本课题拟通过对IND与HD的临床和病理资料的统计,研究术后:EC和神经元形态、分布的关系.虽然对IND的光镜下病理特点有较多报道,但发育不良神经元的超微结构特点仍缺乏研究,这也是本课题的研究目的.同时,并通过对IND的NSE、Cathepsin.D和S-100的免疫组化染色,分析对IND的镜下免疫组化特点和有效的诊断手段. 材料和方法 1.INI)的神经元分布与EC特点 (1)研究对象及临床资料收集:收集2001年～2004年本院诊断的巨结肠手术治疗的患儿,共347例.进行随访(≥6月),评价患儿术后排便,腹胀情况,术后EC发生情况(以随访时间≥6月,发生≥2次EC为反复EC);是否有再次手术. (2)组织切片阅片、分类:根据患儿的病理号,调取所有患儿病理切片,每个病理号一般有4～6张切片,分别标记为A、B、C、D、E、F等,对应取材部位从大体标本痉挛段一移行段-扩张段-切缘,其中首尾编号分别对应痉挛段和切缘.重新阅片后,参照Holschneider提出的有关神经元异常的病理诊断标准进行分类. 2.免疫组化染色根据组织切片结果,调取20例IND病变组织蜡块,同时取5例HD患儿神经元正常肠段组织和2例美克尔憩室肠切除边缘组织,分别进行NSE、Cathepsin-D和S-100免疫组化检测. 3.透射电镜检查 (1)研究对象及取材:巨结肠术中切除肠段立即取材,切取小块肠壁组织,在2.5%戊二醛液体覆盖下,进一步切割组织尽可能小,估计保留肌间组织和两侧部分肌层.样本置2.5%戊二醛4℃保存,根据病理结果,将所需样本分类:神经元正常肠段和IND病变肠段. (2)戊二醛一锇酸双重固定,脱水,浸透,包埋,固化,预切片定位,超薄切片,电镜观察、拍片、记录. 4.数据处理 统计所有HD、IND和HD/IND病变患儿临床资料,病理结果,采用)c2检验行统计学分析,P<0.05认为差异有统计学意义. 结论 1.IND的病变神经元分布与肉眼病变肠段分布有不平衡性,术后EC发生率高,切缘仍有IND病变以及经肛门手术是术后反复EC的危险因素,IND的切除范围仍有不确定性. 2.NSE、Cathepsin-D和S-100三种免疫组化具有互补性,可以分别显示IND的神经丛结构,神经丛内神经元结构数量,神经丛神经纤维增生情况,从而能够对IND进行准确的判断. 3.电镜下,IND病变神经元结构与正常不同,胞浆内神经内分泌囊泡的减少或缺乏,伴有核染色质边聚现象. 收起