中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 胡雯东南大学 2015年博士导师: 韩俊海共127页

摘要 : 视觉是人和动物的主要感觉，它接受了外界绝大多数的信息。视觉信号转导过程是感光受体介导的将胞外光信号快速转变成胞内电信号的过程。视觉信号转导过程完成后，该信号通路中的分子需要被快速去活化恢复到初始状态，以便感知后续光信号的刺激，并避... 展开视觉是人和动物的主要感觉，它接受了外界绝大多数的信息。视觉信号转导过程是感光受体介导的将胞外光信号快速转变成胞内电信号的过程。视觉信号转导过程完成后，该信号通路中的分子需要被快速去活化恢复到初始状态，以便感知后续光信号的刺激，并避免由于视觉信号转导通路长时间开放导致的感光神经元的损伤。视觉信号转导起始于感光受体(Rhodopsin)的活化，随后它可以激活与之偶联的Gq蛋白并开启整个视觉信号转导通路。然而视觉信号通路的分子如何被快速去活化的分子机制还有没有被研究不清楚。在该论文中，笔者研究证实G蛋白不仅在视觉信号转导的激活过程中起到分子开关的作用，其在信号通路的灭活过程中也发挥着重要的作用。我们利用化学诱变剂EMS诱发突变，结合视网膜电位记录筛选获得了一株同时具有视觉信号转导慢激活和慢终止表现的突变果蝇。通过对突变基因定位以及表型挽救实验，我们揭示了上述表型是由于Gq基因突变所导致的。利用电生理学和遗传学相结合的方法，我们证实了Gq分子确实参与光信号转导的灭活过程。缺失Gq分子会引起光信号转导灭活途径的缺陷。此外，我们还运用电生理的方法进一步揭示Gq分子参与调节光受体Rhodopsin的灭活过程。随后，结合生物化学、电生理学、遗传学以及免疫组化的实验，我们揭示了Gq分子参与调节光信号转导去活化途径的分子机制。最后，我们还发现缺失了Gq分子后，果蝇的视网膜会产生退化的疾病。我们的研究揭示了Gq分子在视觉系统中起着重要的作用，除了前人报道的分子开关的作用以外，还有反馈调节分子的作用，并且它的缺失会引起视网膜退化疾病。感光细胞被活化后，能通过突触连接将光信号以神经递质的形式传递给下一级神经元，通过一级一级的中间神经元传递到大脑的神经中枢形成视觉。在视觉形成的这一过程中，存在很多的调节机制。哺乳动物的视觉系统中，水平细胞在视觉同步化、暗适应、光敏感度等调节中起着重要的作用。在果蝇的视觉系统中，无长突细胞（amacrine cell）的功能与哺乳动物的水平细胞相似，其与光感受细胞能形成正向以及逆向的突触结构进行信号的传递。在该论文中，我研究并阐述了无长突细胞对感光细胞的反馈调节途径的分子机制及生理学功能。首先，基于遗传学以及电生理的方法，我们发现了无长突细胞对于感光细胞的活性存在反馈调节的作用，在无长突细胞中抑制神经递质的释放可以完全的消除这种反馈的调节作用。同时，我们运用电生理及遗传学的实验证实了无长突细胞中的Ih离子通道可以通过调节电压门控的钙离子通道从而控制无长突细胞向感光细胞分泌神经递质。随后，运用遗传学的方法我们进行了iGluR的筛选，找到了表达于感光细胞轴突末端，并介导无长突细胞对感光细胞反馈调节的离子型谷氨酸受体——EKAR。最后，结合电生理学及行为学方法，我们证实了无长突细胞对感光细胞的反馈调节通路对于果蝇在暗条件下的运动视觉有着重要的作用。收起

关键词 : 视觉信号光信号转导途径 G蛋白调节机制

2. 红色红曲菌M7中三个G蛋白α亚基基因的功能研究

[学位论文] 雷鸣华中农业大学 2019年博士导师: 陈福生共182页

摘要 : 红曲菌（Monascusspp.），又称红曲霉，是我国重要的药食两用丝状真菌。其发酵产品——红曲，在我国及东南亚地区已经有了将近2000年的应用历史。现代研究发现，红曲菌可产生食品着色成分红曲色素（Monascuspigments，MPs）、降血脂成分莫纳可林K（Mo... 展开红曲菌（Monascusspp.），又称红曲霉，是我国重要的药食两用丝状真菌。其发酵产品——红曲，在我国及东南亚地区已经有了将近2000年的应用历史。现代研究发现，红曲菌可产生食品着色成分红曲色素（Monascuspigments，MPs）、降血脂成分莫纳可林K（MonacolinK，MK）、降血压成分γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid）等有益次级代谢产物（Secondarymetabolites，SMs），因此红曲产品被广泛用作食品着色剂，以及作为降血脂和降血压等药品和保健食品的原料。其中，MPs成分根据其最大吸收波长不同，又可分为黄（330-450nm）、橙（460nm-480nm）、红（490-530nm）三类。另外，有些红曲菌株也可产生一种肾脏真菌毒素——桔霉素（Citrinin,CIT）。促进MPs和MK的产生，控制CIT的产生是目前红曲菌研究的热点之一。 G蛋白信号途径（G-proteinsignalingpathway，GPSP）是一种广泛存在于丝状真菌等生物体内的跨膜信号传导途径，调控其生长、有/无性繁殖以及SMs产生等。GPSP由G蛋白偶联受体（G-proteincoupledreceptor，GPCR）、异三聚体G蛋白（HeterotrimericG-protein，HTGP）与效应因子（Effector，ER）组成。其中，HTGP由α、β、γ三个亚基组成，分别以Gα、Gβ、Gγ表示，它们通常以三聚体Gαβγ形式存在。当GPCR接受信号后，GDP-Gα转化形成GTP-Gα，并与Gβγ二聚体解离，GTP-Gα与Gβγ均可通过激活ER进行信号传递，在GTP水解酶作用下GTP-Gα水解生成GDP-Gα后，与Gβγ重新结合，结束对ER的调控，并准备进行下一轮信号传递。研究发现，丝状真菌中普遍有3类Gα亚基，分属于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个群，它们具有不同的功能。本课题组前期研究发现，在一株高产MPs和CIT，不产MK的红色红曲菌（M.ruber）M7中也存在3个Gα亚基，并且完成了其中一个Gα亚基（Mga1）的功能分析，发现mga1基因的缺失能显著抑制红曲菌M7的菌落生长和有性孢子产生，同时显著促进分生孢子产生，以及MPs和CIT的产量，但是其他两个Gα亚基的功能还不清楚。本研究在此基础上，首先通过单基因敲除、回补和过表达，研究了另外两个Gα亚基（Mga2，Mga3）的功能，然后通过双基因敲除，分析了Mga1、Mga2和Mga3两两双缺失时对红曲菌M7生长、发育和SMs产生等的影响，并通过转录组分析和探讨了GPSP对红曲菌M7生长、发育和SMs产生等的调控。主要研究结果如下。 1.Mga1、Mga2和Mga3的亲缘关系与结构分析首先从NCBI数据库中，分别选取117、114、119株真核生物的Mga1、Mga2和Mga3的氨基酸序列，利用Softbarry和Pfam等软件比较分析了它们的亲缘关系。结果表明，Mga1、Mga2和Mga3均含有Gα蛋白功能域的基因编码序列，且与曲霉属（Aspergillus）的相似度高达75%~98%。并利用Blast和MEGA软件，基于Mga1、Mga2和Mga3的氨基酸序列，分别构建了它们的系统发育树。结果显示，红曲菌M7的Mga1、Mga2和Mga3分化均较晚，且与曲霉属和青霉属（Penicillium）的亲缘关系较近。然后，采用Blast和WebLogo软件，比较分析了Ⅰ-Ⅲ三类真菌Gα的保守氨基酸序列。结果表明，Ⅰ类Gα的氨基酸序列在真菌中高度保守，而Ⅱ类和Ⅲ类Gα的氨基酸序列的保守性较差，且在三类Gα中均存在三个连续保守区域，其氨基酸残基序列分别为MFDVGGQRSERKKWIHCFE、LLLGAGESGKST和ILFLNKD。 2.mga2与mga3的单基因敲除、回补与过表达菌株的构建及表型分析 2.1mga2的敲除、回补与过表达菌株的构建及表型分析通过根癌农杆菌（Agrobacteriumtumefaciem）介导的基因同源重组技术得到了红曲菌M7的mga2的敲除（Δmga2）、回补（Δmga2::mga2）和过表达（M7::PtrpC-mga2）菌株。将得到的菌株在PDA培养基上，28℃培养3-11d，分析了各菌株生长、有/无性繁殖以及MPs与CIT产量的变化。结果显示，mga2对红曲菌M7的生长、有/无性繁殖无影响，但对MPs和CIT的产生影响较大。相比于M7，Δmga2的胞内外黄色素产量明显上升，培养11d时，胞内外黄色素产量达到最大，分别是M7中的1.8倍和2.2倍；Δmga2的胞内橙色素产量降低，在第11d产量仅为M7的50%，胞外橙色素产量增加，在7-11d时分别为M7的1.2倍，1.6倍和1.6倍；Δmga2的胞内外红色素产量与M7无显著差别。回补菌株Δmga2::mga2的胞内外MPs产量与M7相近。过表达菌株M7::PtrpC-mga2中的胞内外黄色素产量与M7相近；胞内橙色素增加，在整个发酵过程中其产量约为M7的1.3~2.4倍，而胞外产量降低，在整个发酵过程中其产量约为M7的40~80%；胞内红色素产量与M7无显著差别。对CIT而言，Δmga2的胞内外CIT产量均升高，培养11d时，其产量分别为M7的1.9倍和2.0倍。Δmga2::mga2和M7::PtrpC-mga2的胞内外CIT与M7的无明显差别。 2.2mga3的敲除、回补与过表达菌株的构建及表型分析同理，构建了Δmga3、Δmga3::mga3和M7::PtrpC-mga3，并在PDA培养基中，28℃培养3-11d，分析了它们的生长、有/无性繁殖，以及MPs与CIT的产量变化。结果显示，与mga2相同，mga3对红曲菌M7的生长、有/无性繁殖无影响，仅影响MPs和CIT的合成。 Δmga3胞内黄、橙、红色素分别是M7的1.1倍、1.6倍和2.9倍；胞外黄、橙、红色素分别是M7的1.2倍、1.6倍和1.6倍。回补和过表达菌株与M7无明显差别。 Δmga3的胞内外CIT产量均升高，培养11d时，它们的产量分别为M7的1.4倍和1.2倍，而回补和过表达菌株的胞内外CIT产量与M7没有显著区别。综上所述，mga2和mga3基因主要调控红曲菌M7中的MPs与CIT的合成，对营养生长、有/无性繁殖的影响不明显。 3.mga1、mga2和mga3两两双基因敲除菌株的构建及表型分析为了进一步研究红曲菌M7中mga1、mga2和mga3对其生长、有/无性繁殖与SMs产生的影响，以Δmga1和Δmga2为出发菌株，分别构建得到了Δmga1+2、Δmga1+3和Δmga2+3双基因敲除菌株，并在PDA培养基中，28℃培养3-11d，对它们的表型进了分析。 3.1双敲除菌株对红曲菌M7的生长和发育的影响在PDA培养基中，28℃培养7d，Δmga1+2的菌落明显小于M7的，不产闭囊壳，分生孢子的数量明显少于M7的；Δmga1+3的菌落比Δmga1+2的更小，菌丝生长紧密，菌落周边的培养基颜色明显变深，不产闭囊壳，分生孢子少；Δmga2+3的菌落大小与有/无性繁殖，与M7无明显差别。 3.2双敲除菌株对MPs和CIT产生的影响在PDA培养基中，28℃培养3-11d，Δmga1+2的胞内外黄色素产量分别是M7的1.5倍和1.8倍，胞内外橙色素产量分别是M7的2.2倍和2.0倍，胞内外红色素产量均为M7的1.9倍；Δmga1+3的胞内外黄色素是M7的1.7倍和3.0倍，胞内外橙色素产量是M7的3.6倍和4.0倍，胞内外红色素产量分别是M7的7.9倍和3.4倍；Δmga2+3对胞内外MPs的产量影响不显著。在PDA培养基中，28℃培养3-11d，Δmga1+2的胞内外黄色素产量分别是M7的1.5倍和1.8倍，胞内外橙色素产量分别是M7的2.2倍和2.0倍，胞内外红色素产量均为M7的1.9倍；Δmga1+3的胞内外黄色素是M7的1.7倍和3.0倍，胞内外橙色素产量是M7的3.6倍和4.0倍，胞内外红色素产量分别是M7的7.9倍和3.4倍；Δmga2+3对胞内外MPs的产量影响不显著。对CIT而言，Δmga1+2胞内外CIT的产量分别约为M7的2.0倍和1.9倍，Δmga2+3胞内外CIT产量分别约是M7的1.6倍和1.4倍，而Δmga1+3菌株早期平均CIT产量（3-7d）仅为M7的20%，后期CIT产量（9-11d）与M7无明显差别。综合MPs与CIT产量，可以发现Δmga1+3菌株在提高各种MPs产量的同时降低CIT产量，这一结果对构建高产MPs工程菌株具有借鉴意义。综上所述，结合mga1、mga2和mga3单基因敲除菌株的分析结果可知，mga1对红曲菌M7的生长、有/无性繁殖与SMs的产生起主要调控作用，mga2可以调控菌落生长和CIT的合成，mga3可以调控菌落生长和MPs的合成。 4.mga1、mga2和mga3单/双基因敲除菌株的转录组分析为了更全面地分析mga1、mga2和mga3单/双基因敲除后对红曲菌M7的影响，将活化后的M7、Δmga1、Δmga2、Δmga3、Δmga1+2、Δmga1+3和Δmga2+3菌株涂布PDA平板，28℃培养，分别于第3d和7d收集菌丝体，提取总RNA，采用RNA-Seq技术比较分析了这些菌株转录组的差异。 4.1差异表达基因（Differentialexpressiongenes,DEGs）分析相对于M7，所有敲除子都有大量基因差异表达，且下调表达的DEGs大于上调表达的DEGs，下调DEGs的数量都在200以上。其中，双敲除菌株Δmga1+3中下调基因数量最多，第3d和第7d下调基因数量分别达到1858个和2000个。 4.2GO和KEGG生物通路分析对DEGs的Geneontology(GO)分析发现，Gα亚基对大多数（超过59%）的GO中的DEGs的表达量的调控，不随培养时间（3d和7d）的变化而变化，而对有些基因的调控表达则随时间而改变。例如，Gα亚基对膜封闭腔（membrane-enclosedlumen）等相关基因的调控表达主要集中在培养早期（3d），对分子功能调节子（molecularfunctionregulator）和细胞骨架（cytoskeleton）等基因的调控表达主要发生在培养中后期（7d）。对DEGs的KEGG（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomespathway）通路分析发现，Gα亚基缺失菌株对生物通路的影响均为大量下调表达的DEGs，表明Gα亚基的敲除，主要的影响表现在抑制相关生物通路的功能。 4.3Gα亚基对红曲菌M7生长和发育相关基因的影响 Gα亚基的单/双基因敲除对碳代谢的影响主要表现为抑制磷酸戊糖途径和三羧酸循环相关酶类的表达；单/双基因敲除在氮代谢的影响均主要表现为，降低氮源的吸收、转运、分解，导致细胞内氨产量减少，并进一步抑制精氨酸合成和谷氨酸代谢等生理过程。在有/无性繁殖方面，单独敲除任一Gα亚基都会造成中心产孢调控基因（在红曲菌M7中主要是brlA与wetA基因）的表达量上升，而同时敲除mga1和mga3基因时能使产分生孢子相关基因的表达量下调。单独敲除mga2基因的菌株对有性繁殖相关基因mat1-2的表达无显著影响；单独敲除mga3基因会使mat1-2基因的前期（3d）表达量升高，后期无显著变化；mga2和mga3双基因敲除菌株对mat1-2基因的表达无显著影响；而mga1的单/双基因敲除菌株都会抑制mat1-2基因的表达，这与mga1基因的单/双基因敲除菌株不产有性孢子的实验结果也是相符的收起

关键词 : 红曲菌红曲色素 G蛋白信号途径 G&alpha 亚基 RNA-Seq

3. β-Arrestin2通过Akt信号途径促进肝癌细胞的侵袭与增殖的机制研究

[学位论文] 刘跃宇苏州大学 2018年硕士导师: 钱海鑫共46页

摘要 : 目的： G蛋白偶联受体（G protein—coupled receptors，GPCRs）是目前已知的最大的细胞表面受体家族，调节信号转导与传播，并且掌控着各种生理和病理流程。GPCRs 调节器ARRBs 在癌症的增殖中起着一定的作用，然而，ARRBs 在肝细胞癌变中的作用... 展开

关键词 : 肝癌 G蛋白偶联受体 &beta -arrestin2 Akt信号途径细胞侵袭

4. 小G蛋白ROP6在百脉根结瘤信号途径中功能及作用机制的研究

[学位论文] 柯丹霞华中农业大学 2012年博士导师: 张忠明共103页

摘要 : 豆科植物分泌类黄酮化合物，能诱导根瘤菌结瘤基因的表达，合成结瘤因子(NF)，结瘤因子作为根瘤菌共生信号分子作用于寄主植物，在结瘤起始阶段发挥关键作用。植物中的结瘤因子受体NFR1和NFR5被认为共同参与接收结瘤因子信号，并与之相结合，然后依次... 展开豆科植物分泌类黄酮化合物，能诱导根瘤菌结瘤基因的表达，合成结瘤因子(NF)，结瘤因子作为根瘤菌共生信号分子作用于寄主植物，在结瘤起始阶段发挥关键作用。植物中的结瘤因子受体NFR1和NFR5被认为共同参与接收结瘤因子信号，并与之相结合，然后依次将结瘤因子信号传递到下游调控结瘤基因，从而引起宿主植物细胞一系列形态、生理及生化变化。尽管NFR5在百脉根结瘤信号转导中起着至关重要的作用，但是它接收并传递结瘤因子信号的生化机制我们知之甚少。我们用酵母双杂交技术筛选出了与结瘤因子受体NFR5相互作用的蛋白-百脉根小G蛋白ROP6，并证实ROP6作为正调节子参与根瘤菌对豆科植物的侵染和根瘤的发育。其主要研究结果如下： 1.以NFR5激酶结构域(NFR5-PK)为诱饵，通过酵母双杂交系统，筛选百脉根AD-cDNA文库分离得到小GTPase ROP6蛋白。利用体外蛋白pull-down以及烟草体内Co-IP等技术证实了全长的NFR5与ROP6蛋白之间的相互作用。同时构建ROP6的两个突变体，组成型活化突变体ROP6-CA(constitutively active mutants)和功能缺失突变体ROP6-DN(dominant negative mutants)。利用体外蛋白pull-down和烟草体内BiFC实验验证了NFR5与ROP6两个突变体蛋白之间的相互作用。 2.利用基因枪轰击洋葱表皮细胞以及农杆菌介导百脉根毛根转化的方法将ROP6基因导入植物细胞，结果表明ROP6定位于植物细胞的细胞膜和细胞质中。我们用双分子荧光互补技术(BiFC)观察NFR5与ROP6在烟草叶片中的相互作用。ROP6和NFR5分别融合到青色荧光蛋白的N末端(SCN)和C末端(SCC)。SCC：NFR5和ROP6：SCN在烟草叶片细胞中共表达时，在细胞膜观察到强烈的青色荧光信号。BiFC实验证实NFR5与ROP6在植物细胞的细胞膜相互作用。 3.通过薄板层析板(TLC)分离GTP和GDP，放射自显影检测水解产物[a-32P]GDP的方法测定ROP6蛋白的GTPase酶活，结果证实野生型的ROP6能够水解GTP，自身具有微弱的GTP酶活，在反应体系中加入NFR1和/或NFR5蛋白均不影响ROP6的GTPase酶活。 4.Real-time PCR结果显示接种根瘤菌以后ROP6基因在百脉根根中的表达量明显升高。为了从细胞学水平检测ROP6基因的时空表达，我们构建了ROP6Pro：GUS重组质粒，用组织化学染色的方法观察ROP6基因在转化毛根中的表达，结果显示接种根瘤菌之前ROP6在根的维管束，根尖，根毛中均有少量表达，接种之后，这些部位表达量显著增加。并且在发育的根瘤皮层中ROP6基因的表达量较高，而成熟和衰老的根瘤中ROP6的表达量明显降低。启动子实验结果与Real-time PCR结果一致，证实了ROP6基因的表达确实依赖于根瘤菌的侵染。因此我们推测ROP6参与根瘤菌的侵染和根瘤的发育。 5.通过RNA干扰(RNAi)技术下调表达ROP6基因，结果显示ROP6的RNAi抑制了植株侵染线的形成和结瘤的起始，导致RNAi植株结瘤数目明显减少。ROP6RNAi毛根中两个早期结瘤素基因NIN和ENOD40-2的表达受到明显抑制，说明ROP6是早期结瘤素基因诱导表达所必须的。这个结果证实ROP6在共生信号转导途径中发挥正调控作用。 6.利用毛根转化技术将ROP6，ROP6-CA，ROP6-DN导入百脉根中过量表达，观察接种根瘤菌后根毛的变形表型，结果显示过量表达ROP6和ROP6-CA使得根毛的变形增加，而过量表达ROP6-DN使得根毛的变形大大减少。说明ROP6的不同活化状态能够影响根毛对结瘤因子的感知，超表达ROP6和ROP6-CA都能够增强根毛对结瘤因子的感知，而超表达ROP6-DN使得根毛对结瘤因子的感知大大降低。收起

关键词 : 百脉根共生信号途径小G蛋白结瘤因子受体蛋白酵母双杂交

5. G蛋白β亚基在昆虫蜕皮激素信号途径中的功能研究

[学位论文] 秦伟杰山东大学 2013年硕士导师: 赵小凡共43页

摘要 : 研究背景、存在的科学问题及研究意义: 昆虫的生长发育需要经历生长、繁殖、死亡的生命过程。昆虫必须通过蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮，20-hydroxyecdysone，20E)的作用起始蜕皮(molting)才能继续生长。全变态昆虫(holometabolous)的一个世代需要经... 展开研究背景、存在的科学问题及研究意义: 昆虫的生长发育需要经历生长、繁殖、死亡的生命过程。昆虫必须通过蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮，20-hydroxyecdysone，20E)的作用起始蜕皮(molting)才能继续生长。全变态昆虫(holometabolous)的一个世代需要经历卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。每一阶段向下一阶段的过渡以及幼虫阶段不同龄期之间的生长发育都需要蜕皮。棉铃虫(Helicoverpa armigera)属于昆虫纲鳞翅目，它的上述蜕皮行为为研究诸如细胞凋亡、分化、组织重建等生命过程提供了良好的实验平台。目前生命科学领域研究的热点课题之一就是甾醇类激素的膜受体，集中于受体的寻找以及信号传递过程的早期阶段的机制，即甾醇类激素的膜受体是否存在以及激素信号是如何与它们的膜受体结合并将信号传递至胞内的。越来越多的研究表明存在甾醇类激素膜受体，并对膜信号途径进行了初步研究。Gβ是异源三聚体G蛋白的亚基，主要功能是与G蛋白γ亚基(Gγ)形成Gβγ二聚体，并与G蛋白α亚基(Gα)形成异源三聚体，接受GPCR信号并将信号向下游传递。有报道显示G蛋白偶联受体(G protein coupled receptors，GPCRs)作为膜受体参与了20E信号途径，并将信号传递至胞内，启动钙离子通道，从而引起细胞程序性死亡。本研究的主要内容集中于GPCR信号途径G蛋白beta亚基(Gβ)。本研究的目的在于探索Gβ参与20E信号途径的方式以及Gβ在其中所起的作用。研究结果: 本文对Gβ基因在棉铃虫组织的分布以及发育阶段的转录水平变化进行了初步探索，通过添加外源蜕皮激素的方式研究蜕皮激素对该基因转录水平的影响，并且通过RNA干扰技术研究沉默此基因后对于20E信号途径中的重要基因转录水平的影响。研究发现该基因在棉铃虫四种组织中均有不同程度的表达，并且该基因在棉铃虫变态期的中肠组织中表达量较高，而此时20E滴度正处于峰值。棉铃虫表皮细胞系以及虫体水平的激素刺激实验都表明该基因可被20E上调表达。沉默该基因后，幼虫的生长发育受到影响，20E调控的多个重要转录因子转录水平下调，这表明Gβ基因参与20E信号途径。该基因的亚细胞定位也可受20E的诱导而由细胞膜附近向胞质内迁移，这表明20E可通过非基因组途径参与对细胞生命活动的调节。研究结论与意义: 本文通过研究发现了鳞翅目昆虫棉铃虫中的一种G蛋白β亚基在幼虫发育的变态期中肠组织中高表达，首次发现该基因可直接参与20E信号转导途径，并响应20E的诱导上调;沉默该基因后，幼虫生长发育延迟，与20E途径相关的重要早期基因转录水平受到抑制;并且发现20E可诱导该基因向细胞质内的迁移。本文结果为研究20E通过G蛋白信号途径调节昆虫幼虫蜕皮变态提供了新的数据支持。收起

关键词 : G蛋白&beta 亚基蜕皮激素信号途径膜受体亚细胞定位

6. RGS4蛋白在不同表达体系中对阿片受体信号转导途径的影响及其在细胞内定位的初步研究

[学位论文] 俞丽雅北京协和医学院(中国医学科学院) 2002年博士导师: 张德昌共58页

摘要 : RGS（regulator of G protein signalling）蛋白是近年来发现的一类对G蛋白信号转导过程起调节作用的蛋白.阿片受体是G蛋白偶联的七螺旋跨膜受体.研究比较瞬时表达的RGS4蛋白在瞬时表达和稳定表达μ受体的HEK-293细胞中对μ受体激活后腺苷酸环化酶抑制... 展开

关键词 : RGS G蛋白 AC 阿片受体 G蛋白信号转导

7. cAMP-PKA信号途径对线虫天然免疫分子机制的研究

[学位论文] 肖毅云南大学 2013年硕士导师: 邹成钢共105页

摘要 : G蛋白信号途径广泛地参与了各自生命过程，包括天然免疫。秀丽隐杆线虫是研究天然免疫的常用模型。目前已被证实的参与线虫天然免疫的G蛋白有G12α蛋白GPA-12和Gqα蛋白EGL-30。然而，是否还有其他G蛋白参与线虫的天然免疫还不清楚。在本研究中，我们... 展开

关键词 : 秀丽隐杆线虫 cAMP-PKA信号途径 G蛋白通路天然免疫 GATA转录因子

8. G蛋白偶联受体激活MAPK的信号转导及MAPK在受体脱敏中的作用机制

[学位论文] 张喆中国科学院上海生命科学研究院 2001年博士导师: 裴钢共100页

摘要 : 该论文以哺乳动物非神经细胞系中华仓鼠卵巢癌细胞和神经细胞系神经母细胞瘤与神经胶质瘤杂交的NG108-15细胞为模型,研究了从以阿片受体为代表的G蛋白偶联受体到MAPK家族蛋白激酶的信号转导,深入探讨了MAPK在受体脱敏过程中的作用及其机制.

关键词 : G蛋白偶联受体 MAPK 阿片受体 G蛋白信号转导

9. Gαq亚基在棉铃虫蜕皮激素信号途径中的功能研究

[学位论文] 任静山东大学 2014年硕士导师: 赵小凡共62页

摘要 : 研究背景，存在的科学问题以及研究意义：昆虫需要经过生长发育才能代代繁衍，长盛不衰。昆虫的发育主要包括蜕皮与变态两个过程。昆虫的蜕皮变态主要受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)的调控。20E和JH相互拮抗，共同调控昆虫的生长发育和与蜕皮变... 展开研究背景，存在的科学问题以及研究意义：昆虫需要经过生长发育才能代代繁衍，长盛不衰。昆虫的发育主要包括蜕皮与变态两个过程。昆虫的蜕皮变态主要受蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)的调控。20E和JH相互拮抗，共同调控昆虫的生长发育和与蜕皮变态。在幼虫期，20E滴度较高，可启动蜕皮的发生;在幼虫末龄期，20E滴度再次升高，启动变态的发生。20E作为一种甾醇类激素，具有经典的基因组信号途径，即20E直接进入细胞核与核受体结合启动基因转录。但是越来越多的研究发现有些甾醇类激素具有非基因组信号途径，例如雌激素和油菜素内酯，此二者亦具有膜受体。G蛋白偶联受体(Gproteincoupledreceptors，GPCRs)作为一种膜受体参与众多信号转导途径，将胞外第一信使转化为第二信使，开启下游级联反应。异源三聚体G蛋白与GPCR偶联，由α，β，γ三种亚基组成。Gαq属于Gα的一种亚型，本论文主要研究Gαq亚基是否参与20E信号通路，并对棉铃虫蜕皮变态产生何种影响。在理论上可以深入揭示昆虫蜕皮变态的分子机制，进一步了解甾醇类激素非基因组信号途径;在应用上能为害虫防治提供靶标基因。研究结果与结论：棉铃虫属于鳞翅目夜蛾科昆虫，作为一种完全变态昆虫，需要经历卵，幼虫，蛹，成虫四个发育时期。我们以之为实验材料，通过虫体与细胞系干扰，磷酸化检测，钙离子流向测定等方法，研究了Gαq在棉铃虫蜕皮变态中的作用，揭示了Gαq以一种非基因组信号途径的方式参与20E信号通路，并对20E基因组信号通路进行调控。主要获得如下实验结果和结论: 1.20E通过Gαq调控基因的转录和变态发生 Gαq在棉铃虫变态期高表达，能被20E诱导上调。虫体干扰显示Gαq参与了20E诱导的蜕皮变态，干扰Gαq能延迟变态时间，导致虫体死亡。虫体和细胞系干扰均会导致20E基因组信号途径中一系列重要的基因发生下调。 2.20E调控Gαq向膜迁移免疫细胞化学结果显示Gαq主要分布在细胞质中，在20E的诱导下可以快速向细胞膜附近迁移。GPCR抑制剂可以阻断20E诱导的Gαq向膜迁移。20E通过PKC介导Gαq发生磷酸化决定迁移。 3.Gαq参与20E诱导的细胞内钙离子水平的升高 20E可以在短时间内诱导细胞内钙离子水平升高，包括内钙释放和外钙内流。干扰Gαq后，20E既不能诱导胞内钙离子释放，也不能诱导胞外钙离子内流。说明Gαq可参与20E调控的胞内钙离子水平快速变化，包括内钙释放和外钙内流。 4.20E通过Gαq调控PKC介导的CDK10和USP1的磷酸化 CDK10和USP1能够被20E诱导发生PKC介导的磷酸化。细胞系干扰Gαq后，CDK10和USP1不能被20E诱导发生磷酸化。20E通过Gαq调控USP1的磷酸化，进而影响下游基因转录的启动，最终影响昆虫蜕皮变态的发生。创新点及意义：本论文研究了Gαq在棉铃虫20E信号转导通路中的作用，揭示了Gαq以一种非基因组信号转导途径来调控20E基因组信号途径，为20E信号途径具有膜受体提供了实验支持，并为后续控制害虫靶标分子的筛选提供理论支持。收起

关键词 : G&alpha q亚基棉铃虫蜕皮激素信号途径

10. APJ受体羧基末端磷酸化位点对G蛋白非依赖信号途径的影响

[学位论文] 陈小娱山东大学 2015年博士导师: 刘传勇；陈京共145页

摘要 : 研究背景及目的： G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)是目前已知最大的细胞膜表面受体超家族，可将胞外的多种信号分子（如气味、光、多肽、脂质、激素等）传至细胞内部，从而调节和维持生物体的稳态。GPCRs在人体内广泛表达，... 展开研究背景及目的： G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors，GPCRs)是目前已知最大的细胞膜表面受体超家族，可将胞外的多种信号分子（如气味、光、多肽、脂质、激素等）传至细胞内部，从而调节和维持生物体的稳态。GPCRs在人体内广泛表达，其信号传导通路的失调与多种疾病的发生发展密切相关。目前，临床上超过50％的药物以GPCRs作为靶点。本研究旨在阐明APJ羧基末端确切的磷酸化位点，观察这些位点对APJ受体的脱敏、内吞和G蛋白非依赖的信号途径的影响，进而为心血管系统药物的筛选提供新的实验依据和思路。研究方法： 1.细胞培养和转染: 采用人胚胎肾细胞(HEK293)作为研究对象;脂质体Lipofectamine2000为转染试剂转染细胞。 2.质谱检测: 提取APJ受体蛋白，通过烷基化和富集处理后，LC-MS/MS质谱分析APJ受体的磷酸化位点。 3.点突变及真核表达载体的构建: 重叠延伸PCR技术将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代;限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切扩增产物和载体、连接、转化、质粒提取、酶切鉴定、基因测序鉴定，构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体。 4.酶联免疫吸附实验: 检测细胞膜表面野生型APJ受体及APJ突变体的表达量;检测细胞内cAMP的含量。 5.放射性配体结合实验: 检测野生型APJ受体或构建的APJ突变体与配体的结合力。 6.激光共聚焦共聚焦实验: 检测野生型APJ受体及APJ突变体在细胞膜表面的定位及受体内吞过程。 7.剂量反应和实时动态BRET实验:@检测野生型APJ受体或APJ突变体与GRK2/5或β-arrestin1/2相互作用的剂量反应和实时动态关系。 8.免疫共沉淀实验: 检测APJ受体与β-arrestin1或β-arrestin2之间的相互作用。 9.细胞内钙离子检测实验: Fluo-4 NW检测激动剂刺激对细胞内钙离子含量变化的影响。 10.Western blot实验: 检测激动剂对细胞内ERK1/2磷酸化水平的影响。 11.统计学分析: 所有数据采用均数±标准误（Mean±SEM）表示，采用GraphPad Prism5.0软件进行统计学分析。研究结果： 1.APJ受体羧基末端磷酸化位点的鉴定 NetPhos2.0分析软件预测APJ受体蛋白序列的磷酸化位点分别为ser335、ser345和ser348。随后，质谱分析法明确apelin-13刺激后，APJ受体确定的磷酸化位点为ser345和ser348。 2.APJ受体突变体真核表达载体的构建将APJ受体羧基末端335、345和348位点的丝氨酸(S)用丙氨酸(A)替代。构建人APJ受体羧基末端磷酸化位点突变的真核表达载体，测序证实突变体重组质粒构建正确。 3.野生型APJ受体和APJ受体突变体的亚细胞定位分析 ELISA和BRET实验发现APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A突变体与野生型APJ受体表达量相当，点突变对APJ受体的细胞膜表面表达没有产生明显的影响，差异无统计学意义。 4.野生型APJ受体或APJ受体突变体对配体结合力的影响放射配体结合分析技术证实APJ受体羧基末端磷酸化位点的突变并不影响配体的结合。至少，ser335、345和348并不是apelin-13结合的关键位点。 5.野生型APJ受体和APJ受体突变体的功能鉴定稳定表达野生型APJ受体或APJ受体突变体的HEK293细胞中，APJ-S335A、APJ-S345A和APJ-S348A三种突变体都以剂量依赖性的方式抑制了弗司可林(forskolin，FSK)诱导的cAMP生成。同样，apelin-13均能诱导三种突变体胞内Ca2+释放的显著性增加，与野生型APJ受体基本一致。 6.APJ受体丝氨酸348位点对apelin-13诱导的受体内吞的影响在稳定表达APJ受体的HEK293细胞，apelin-13(100nM)刺激5min后受体内吞开始。激动剂作用30min，大约有50％的受体离开细胞膜表面发生内吞。激动剂持续60min后，大约70％的受体回到细胞膜表面。与野生型APJ受体比较，apelin-13诱导的APJ-S335A和APJ-S345A突变体内吞没有发生明显改变。然而，ser348位点的突变使受体的内吞作用受到明显抑制。激光共聚焦实验发现，野生型APJ受体和APJ-S335A、APJ-S345A、APJ-S348A突变体清晰的表达在细胞膜的表面。激动剂的作用下，APJ-S335A和APJ-S345A突变体的内吞过程与野生型受体相似。然而，在apelin-13的刺激下，APJ-S348A突变体失去了向胞浆移位的能力，不能与胞浆中的β-arrestin1或β-arrestin2蛋白发生共定位。 7.APJ受体丝氨酸348位点对GRK2/5或β-arrestin1/2募集的影响 BRET2检测apelin-13对APJ与GRK2/5相互作用的剂量反应关系。研究表明，GRK2被招募到激动剂活化的受体。EC50值分别为:6.58±0.58nM(WTAPJ)，6.20±1.56nM(APJ-S335A)，5.69±1.42nM(APJ-S345A)。同样，APJ与GRK5相互作用的EC50值分别为:9.45±2.58nM(WTAPJ)，8.20±1.85nM(APJ-S335A)，7.34±1.17nM(APJ-S345A)。然而，在不同浓度激动剂的作用下，APJ-S348A突变体均失去了与GRK2或GRK5相互作用的能力。 BRET1检测apelin-13对APJ与β-arrestin1/2相互作用的剂量反应关系。研究表明，β-arrestin1与野生型受体或突变体相互作用的EC50值分别为:5.69±0.71nM(WTAPJ),5.06±1.05nM(APJ-S335A),5.55±0.94nM(APJ-S345A)。β-arrestin2与野生型受体或突变体相互作用的EC50值分别为:8.29±1.25nM(WTAPJ),7.25±0.73nM(APJ-S335A),7.55±1.03nM(APJ-S345A)。 APJ-S348A突变体均失去了与β-arrestin1或β-arrestin2相互作用的能力。免疫共沉淀实验发现只有在FLAG-β-arrestin1（或FLAG-β-arrestin2）和HA-APJ共转染的细胞样品中，显示出HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应的条带。而在FLAG-β-arrestin1（或FLAG-β-arrestin2）和HA-APJ-S348A共转染的细胞样品及对照组中，均未发现HA抗体沉淀下来的抗FLAG抗体反应免疫条带。浓度依赖的ERK1/2磷酸化实验显示:不同浓度的apelin-13作用15min，HEK293-APJ绌胞表现出浓度依赖的ERK1/2磷酸化。然而，激动剂作用HEK293-APJ-S348A细胞相同的时间，各种浓度的apelin-13均未诱导出ERK1/2的磷酸化。继而缩短激动剂的作用时间，观察apelin-13刺激5min，HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞引起ERK1/2磷酸化的剂量依赖关系，结果并未发现两组绌胞表现出统计学的差异。 PTX预处理阻断Gαi/o蛋白后，结果发现HEK293-APJ细胞和HEK293-APJ-S348A细胞，apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化均表现出明显的降低。转染特异的shRNA抑制胞内的β-arrestin表达，观察apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化过程。结果发现，转染shRNA对照组的HEK293-APJ细胞，apelin-13诱导的ERK1/2磷酸化与未转染组完全一致。然而，HEK293-APJ细胞分别转染β-arrestin1 shRNA或β-arrestin2 shRNA，apelin-13作用15min后的ERK1/2磷酸化水平明显降低。HEK293-APJ348细胞中转染β-arrestin shRNA后，apelin-13诱导的晚期ERK1/2磷酸化同样处于极低的水平，与野生型受体比较无显著性差异。结论： APJ受体的348位氨基酸是GRKs和β-arrestin结合的关键位点，其突变影响了受体的脱敏、内吞、复敏过程以及G蛋白非依赖的ERK1/2磷酸化。然而，APJ受体ser348位点的突变并不影响G蛋白的活化以及G蛋白下游的信号通路。因此，APJ-S348A突变体表现出偏向性受体的特性，其产生的偏向性信号有助于新的药物设计和研发。收起

关键词 : 人体细胞学 G蛋白非依赖信号途径 APJ受体羧基末端磷酸化位点