中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

[学位论文] 王深垒河南大学 2020年硕士导师: 郜晓峰;张永州共66页

摘要 : 在中药材的储存、制备等过程中会发生致病菌污染，沙门氏菌是常见的食源性微生物致病菌之一，感染后会导致中毒、呕吐、腹泻等病状，因此对沙门氏菌检测是必要的、严格的，而传统的微生物学检测方法繁琐、灵敏度低，未能达到快速检测需求。因此，利用... 展开在中药材的储存、制备等过程中会发生致病菌污染，沙门氏菌是常见的食源性微生物致病菌之一，感染后会导致中毒、呕吐、腹泻等病状，因此对沙门氏菌检测是必要的、严格的，而传统的微生物学检测方法繁琐、灵敏度低，未能达到快速检测需求。因此，利用现代分子生物学技术,提高检测的特异性和灵敏度已经成为人们关注的热点。本实验以沙门氏菌为研究对象，根据国标及文献中沙门氏菌常见毒力基因invA、fimI、mgtC和fimA，分别设计合成了沙门氏菌毒力基因invA、fimI、mgtC和fimA的4对引物。提取鼠伤寒沙门氏菌CMCC50071、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、肠炎沙门氏菌CICC21482、沙门氏菌CMCC50956、沙门氏菌CMCC50957、沙门氏菌CMCC50958、以及沙门氏菌CMCC50959的全基因组DNA；以提取的沙门氏菌菌株的全基因组DNA为模板，PCR扩增，分别得到invA、fimI、mgtC和fimAPCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶对目的产物invA、fimI、mgtC和fimA的分离纯化，并分别将纯化过的目的片段invA、fimI、mgtC和fimA进行连接与转化，克隆到载体pLB-simpleVector中，构建含invA、fimI、mgtC和fimA目的片段的重组质粒DNA；利用菌落PCR和测序对重组质粒进行验证，经验证转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存，将其进行冻干制成冻干粉，用于检测沙门氏菌的标准品。结果成功构建出毒力基因invA、fimI的重组质粒，进行均一性，随机性，稳定性检测，结果表明浓度、纯度和稳定性均达到要求，从而完成对沙门氏菌毒力基因质粒定性标准品的制备。本实验采用来自河南焦作四大怀药，共81批次，其中怀菊花23批，怀山药18批，怀地黄20批，怀牛膝20批，提取81批四大怀药的全基因组DNA，进行PCR扩增，用沙门氏菌常见毒力基因invA、fimI质粒DNA标准品做阳性对照，以无菌水做阴性对照，用于81批怀药样品的检测，实验结果显示，结果在81批样品中fimI没有被检测出，检出率为0，有2批菊花样品检测出invA，检出率为8.69%，1批地黄样品中检测出invA，检出率为5.00%，选择被污染的菊花和地黄样品，用传统微生物检测方法进行检测，样品经过增菌培养后，在选择性显色培养基平板上第8批次地黄样品、第15批次菊花样品不长菌落，第7批次菊花在选择性平板上长出了沙门氏菌的典型菌落形态，选取纯化的单菌落进行PCR扩增16SrRNA送测序比对，从而完成对81批次怀药中沙门氏菌的研究应用。与传统方法相比，PCR检测效率更高，耗时更短。本研究以食源性微生物沙门氏菌为研究对象，构建沙门氏菌中常见毒力基因的质粒DNA标准品并将其用到中药中进行检测，提供了一种临床上可以应用的技术和质粒标准品，也为临床上溯源提供了帮助。收起

关键词 : 沙门氏菌质粒标准品质粒DNA 怀药检测

2. 铜绿假单胞菌粘附性质粒及R质粒的实验研究

[学位论文] 常江吉林大学 1999年硕士导师: 关显智共32页

摘要 : 假单胞菌属(pseudomonas)细菌为一群需氧,氧化酶阳性的革兰氏阴性杆菌.包括很多种细菌,到目前为止已超过200种.铜绿假单胞菌(p.aeruginosa)通称绿脓杆菌,是假单菌属中最常见的菌种,也是该菌属的代表菌种.该文围绕着绿脓杆菌PA36株菌毛与炽附的关系,粘... 展开

关键词 : 绿脓杆菌粒附性质粒 R质粒

3. 大鼠催乳素基因真核表达质粒的构建及应用研究

[学位论文] 周远征北京协和医学院(中国医学科学院) 1997年硕士导师: 许荣昆共70页

摘要 : 垂体瘤是一种发病率较高的内分泌系统的肿瘤,其中以催乳素瘤最常见.因此,建立一种催乳素瘤的动物模型,并研究其发病机制既有重要的理论意义,又能够为临床诊断和治疗提供依据.基于此目的,作者以前的研究成功地建立了比较理想的大鼠催乳素瘤的动物模型,... 展开

关键词 : 大鼠基因质粒

4. 多重耐药质粒IncHI2、IncFII33在鸡场大肠杆菌中的流行规律及其特征分析

[学位论文] 林晴晴华南农业大学 2020年硕士导师: 刘健华共67页

摘要 : 近年来，细菌耐药性发展愈演愈烈，尤其是多重耐药、泛耐药及全耐药菌株的出现与流行，已成为全球公共健康难题。质粒作为临床多种重要耐药基因的主要载体，可介导耐药基因在不同地区、来源及菌种之间传播。肠杆菌中部分质粒常同时携带多个耐药基因，... 展开近年来，细菌耐药性发展愈演愈烈，尤其是多重耐药、泛耐药及全耐药菌株的出现与流行，已成为全球公共健康难题。质粒作为临床多种重要耐药基因的主要载体，可介导耐药基因在不同地区、来源及菌种之间传播。肠杆菌中部分质粒常同时携带多个耐药基因，通过水平传播介导这些耐药基因共转移，从而形成多重耐药株，如IncHI2和IncFII质粒。IncHI2和IncFII型质粒是肠杆菌科细菌中的主要流行质粒，IncFII质粒中的IncFII33亚型是国内动物源大肠杆菌的流行质粒之一，这两种质粒是blaCTX-M、fosA3、floR、tetA、oqxAB和mcr-1等耐药基因传播的主要载体。因此，有必要探究这两种质粒在动物源大肠杆菌中的流行分布及其质粒特征，为减缓多重耐药菌的发展提供理论依据。对不同年代、地区及来源的6173株动物源大肠杆菌中的IncHI2和IncFII33质粒的流行情况进行调查，发现不同年代大肠杆菌中IncHI2质粒的检出较为稳定，IncFII型质粒的检出虽然呈下降趋势，但IncFII33亚型在2007年出现后呈缓慢上升趋势。对不同地区的质粒流行情况进行调查，发现安徽某鸡场大肠杆菌中的IncHI2和IncFII33质粒检出率显著高于其他来源的菌株。随后对2015年～2018年间该鸡场分离的174株大肠杆菌中进行质粒流行性分析，结果显示该鸡场中IncHI2质粒检出率为31.61%(55/174)，IncFII质粒检出率为52.30%(91/174)，其中34.07%(31/91)的IncFII质粒为IncFII33亚型，且检出率呈逐年上升趋势。药物敏感性结果显示，IncHI2、IncFII33质粒阳性菌株对头孢喹肟、头孢噻肟、氟苯尼考、黏菌素及磷霉素等多种药物的耐药率显著高于不携带这两种质粒的菌株。PFGE分型结果表明，除部分菌株可能为克隆传播外，其它携带这两种质粒的菌株大部分为非克隆株，提示在该养殖场可能长期存在IncHI2和IncFII33质粒的水平传播。对IncHI2和IncFII33阳性菌株进行接合或转化实验，分别获得17株和18株单质粒接合子/转化子。其中，IncHI2质粒大小在180～336.5kb之间，常携带blaCTX-M-14(n=8)、blaCTX-M-55(n=2)、blaCTX-M-65(n=2)、floR(n=14)、rmtB(n=2)和mcr-1(n=3)等在内的多种耐药基因。IncFII33质粒大小介于54.7kb～160kb之间，主要携带blaCTX-M-55(n=15)、fosA3(n=16)和rmtB(n=8)等耐药基因。通过接合频率和质粒稳定性来探讨影响这两种质粒的传播因素，其中IncHI2质粒的接合频率介于10-6～10-4之间，IncFII33质粒的接合频率介于10-3～10-2之间。在没有药物选择压力下，对IncHI2和IncFII33阳性菌株进行32天的稳定性实验，发现IncFII33质粒仍能稳定的存在，相比之下，IncHI2质粒的丢失情况更为明显。通过全基因组测序结果，对两个IncHI2质粒pHNA8M074和pHNA8M068-1，及一个F33:A-:B-质粒pHNA8M068-2分别进行结构解析，发现这两种质粒的骨架序列及其结构均较为保守，但它们的可变区由于各种可移动元件的插入导致DNA分子的重排、插入和缺失，与其他质粒的可变区存在一定程度上的差异。综上所述，在该鸡场大肠杆菌中，IncHI2和IncFII33为主要的流行性质粒，介导了多种耐药基因如blaCTX-M、fosA3、floR、tetA、oqxAB等的传播。与IncHI2质粒相比，IncFII33质粒良好的稳定性和高效的接合频率能促进该质粒在不同菌株之间广泛传播。除此之外，这些质粒可以通过可移动元件捕获其他耐药基因，因而在抗生素择压力下，这些多重耐药质粒在该养殖场中持续流行。收起

关键词 : 大肠杆菌耐药性 IncHI2质粒 IncFII33质粒

5. 呼吸道肺炎克雷伯氏菌耐药性的研究

[学位论文] 常新吉林大学 1996年硕士导师: 谭可安;卢连根共25页

关键词 : 肺炎克雷伯氏菌耐药质粒质粒分析

6. pND6-1质粒中重复萘降解基因的鉴定和生态意义

[学位论文] 赵化冰南开大学 2005年博士导师: 蔡宝立共162页

摘要 : 许多细菌具有降解环境中生物异源物质的能力，其降解基因常位于质粒上。萘是常见的环境污染物，在工业废水中的检出率高达10％。ND6是本实验室分离的高效降解萘的菌株，它可以在无机盐液体培养基中于48h内将2g/L的萘降解98％。该菌株含有两个大质粒，... 展开许多细菌具有降解环境中生物异源物质的能力，其降解基因常位于质粒上。萘是常见的环境污染物，在工业废水中的检出率高达10％。ND6是本实验室分离的高效降解萘的菌株，它可以在无机盐液体培养基中于48h内将2g/L的萘降解98％。该菌株含有两个大质粒，其中与萘降解有关的是101858bp的质粒pND6-1，另一个122055bp的质粒pND6-2功能不明。pND6-1中9个萘降解基因(nahAaAbAcAdBFCED)构成上游操纵子，它们编码的酶催化萘降解成水杨酸，另外11个萘降解基因(nahGTHINLOMKJY)构成下游操纵子，负责将水杨酸降解成儿茶酚，并通过间位裂解途径将儿茶酚进一步降解成可以进入三羧酸循环的小分子物质。尼龙寡聚体质粒pOAD2、2,4-D质粒pJP4及萘降解菌PseudomonasstutziriAN10的染色体上都存在重复降解基因。重复降解基因的存在并非偶然事件，它是细菌为了适应环境长期进化的结果。生物信息学分析表明，萘降解质粒pND6-1中除了“经典”的水杨醛脱氢酶基因nahF和水杨酸羟化酶基因nahG外，还存在它们的重复基因nahV和nahU，这两个重复基因分别位于萘降解的上游操纵子和下游操纵子之外。本论文的主要研究内容是：通过16SrRNA基因序列分析和Biolog代谢指数测定确定ND6菌株的分类地位；通过滤膜杂交实验确定pND6-1质粒能否进行接合转移；克隆和表达两个重复的萘降解基因nahV和nahU并对它们编码的酶进行纯化和鉴定；通过DNA杂交实验证明nahU基因存在的普遍性并对其生态意义进行探讨。对ND6菌株的16SrRNA基因序列所进行的PCR扩增、克隆、测序和Blast分析表明，它与假单胞菌属的多株细菌具有99％的同源性。Biolog代谢指数测定结果显示ND6菌株与恶臭假单胞菌的匹配程度为0.65。综合上述两项实验结果，ND6菌株被鉴定为恶臭假单胞菌(Pseudomonaseputida)。滤膜杂交实验表明，ND6菌株的pND6-1质粒可以通过接合作用转移到大肠杆菌AD256菌株中。由于ND6菌株不含有接合转移基因，所以推测pND6-2质粒中的8个接合基因与pND6-1质粒的转移有关。这是第一个报道，一个质粒的接合基因可以促进另外一个降解质粒的转移。以pND6-1为模板，设计引物分别对重复的水杨醛脱氢酶基因nahV和重复的水杨酸羟化酶基因nahU进行PCR扩增，然后分别在高表达载体pET-21b(+)中定向克隆，并在E.coliBL21(DE3)细胞中于20℃低温表达。将C-端带有HisTag的重组蛋白通过Ni-NTA亲和层析加以纯化，然后对两种新酶NahV和NahU的酶学性质进行详细研究，并与它们对应的同工酶NahF和NahG的性质进行比较。 NahV具有广泛的底物范围，它能以水杨醛、5-氯水杨醛、间硝基苯甲醛、辛醛、甲醛、邻硝基苯甲醛、邻甲氧基苯甲醛、戊二醛和乙二醛为底物进行催化反应，而且NahV和NahF对不同底物的催化效率不同。NahV对底物水杨醛和辅酶NAD+的米氏常数Km值及最大反应速度Vmax都小于NahF，这表明NahV对底物浓度更加敏感，相对更低的底物浓度就可以促进酶促反应的发生，但是在相同底物浓度的情况下NahF催化的反应速度要比NahV快。Fe2+对NahV和NahF都有显著的激活作用，而Cu2+、Zn2+只对NahV有激活作用。生物信息学分析发现，水杨醛脱氢酶重复基因nahV与其它菌株的水杨醛脱氢酶的氨基酸序列同源性仅为56％，是完全不同的新基因。所有醛脱氢酶都具有保守的氨基酸序列LELGGKSP，但是在NahV的保守氨基酸序列中，丝氨酸(S)被丙氨酸(A)所替换。GPC凝胶色谱分析结果表明，NahV蛋白可能由两个相同的亚基构成。 NahU也具有广泛的底物范围，能以水杨酸、乙酰水杨酸、磺基水杨酸、甲基水杨酸、氯代水杨酸和3,5-二硝基水杨酸为底物进行催化反应。NahU对底物水杨酸和辅酶NADH的Km值和Vmax值都要大于NahG。核酸序列比较表明，水杨酸羟化酶重复基因nahU是与nahG和另一个重复基因nahW都不相同的新基因。NahU和NahG都属于单加氧酶家族，它们都拥有辅酶FAD的结合位点GxGxxG。以质粒pND6-1上“经典”的水杨酸羟化酶基因nahG和重复的水杨酸羟化酶基因nahU为探针，分别与分离自纪庄子污水处理厂的活性污泥和大港油田及天津香料厂混合废水的萘降解菌的总DNA杂交，结果表明，在被检测的14个菌株中都存在nahG基因，而nahU基因只存在于来自混合工业废水的菌株中。这表明，类nahU基因广泛存在于自然界的萘降解细菌中，但不是必需的，是否存在这类基因可能与细菌的生长环境有关。收起

关键词 : 萘降解质粒质粒转移萘降解基因 NahV NahU

7. 宠物源大肠杆菌中多重耐药融合质粒的形成机制研究

[学位论文] 于丽洁河南农业大学 2023年硕士导师: 潘玉善共70页

摘要 : 大肠杆菌是国内外最常报道的人兽共患条件性致病菌，抗菌药的长期使用导致耐药菌株的不断出现和广泛传播。宠物作为人类的伴侣动物，共同的生活环境和长期的直接接触使宠物源细菌成为耐药基因在人类和环境间传播的重要媒介。质粒常作为抗性基因的载体... 展开大肠杆菌是国内外最常报道的人兽共患条件性致病菌，抗菌药的长期使用导致耐药菌株的不断出现和广泛传播。宠物作为人类的伴侣动物，共同的生活环境和长期的直接接触使宠物源细菌成为耐药基因在人类和环境间传播的重要媒介。质粒常作为抗性基因的载体在细菌繁殖时垂直传播或在不同菌株之间水平转移。菌株内某些可接合性质粒在发生自我转移的同时可以作为接合辅助性质粒帮助不可接合质粒发生转移，此过程可能会发生抗性基因的积累和质粒的进化，使抗性基因的传播更加迅速，给临床治疗带来困扰。本研究旨在通过对一株多重耐药的宠物源大肠杆菌中质粒融合和转移进行研究，阐明质粒融合的作用机制，为临床中减少质粒融合和抗性基因的传播提供理论基础。在郑州的三家宠物医院中采集到106株大肠杆菌，进行药物敏感性试验，挑选多重耐药菌株共44株，其中头孢噻肟的抗性最为普遍。结合PCR扩增结果选择其中1株多重耐药菌株HB42进行深入研究。HB42对氨苄西林、头孢噻肟、氟苯尼考、阿米卡星、庆大霉素和黏菌素呈高度耐药。PCR扩增检测出HB42携带抗性基因blaCTX-M-14、blaCTX-M-55、rmtB、floR、mcr-1，且未在染色体上发现相关抗性基因，判断其位于菌株中的质粒上。通过全基因组测序发现HB42共携带5个不同大小的质粒，通过接合试验，在接合子中发现两个不同大小、不同抗性的融合质粒，通过Southern杂交确定是floR阳性的不可接合质粒pHB42-3分别与blaCTX-M-55阳性接合型质粒pHB42-2和mcr-1阳性接合型质粒pHB42-4发生融合，进一步全基因组测序分析，结果表明质粒pHB42-3携带的IS26攻击质粒pHB42-2和pHB42-4的目标位点使质粒发生重组而形成融合。生物学特性研究表明在连续15天的传代培养中融合质粒相当稳定。pHB42-3与pHB42-2或pHB42-4形成融合的重组频率分别为1.94×10-6和1.26×10-8。pHB42-F1和pHB42-F2以更高的频率（2.7×10-4和5.7×10-3）向受体菌株大肠杆菌J53中进一步转移。融合质粒的高稳定性和水平传递性可能促进不可接合质粒中耐药基因的稳定存在和快速传播。 recA缺失不影响pHB42-2和pHB42-3的融合频率（从7.3×10-5到4.3×10-5），说明影响融合频率的因素主要位于子质粒上。对子质粒形成融合质粒的重组位点进行研究，发现子质粒pHB42-3和pHB42-2存在另外的质粒融合模式。在含氟苯尼考和头孢噻肟的琼脂平板上随机选取200株接合子，通过使用pHB42-F1的融合位点引物和预测引物对200株接合子进行PCR扩增，发现另外4种不同的融合模式，但200株接合子中已确定融合模式的质粒仅占29.5%。pHB42-2和pHB42-3形成融合是由于pHB42-3中IS26或TnAs1攻击pHB42-2中不同的靶位点（包括8bp核苷酸序列或pHB42-2中的IS26和TnAs1）。本研究首次在单一菌株中证明质粒存在多种融合模式，由TnAs1和IS26介导质粒的融合。综上所述，融合质粒的形成有助于非接合型耐药质粒的转移传播，加速了抗性基因的快速传播和质粒进化。临床中应谨慎、合理使用抗菌药物，以避免或减缓多重耐药细菌的产生与散播。收起

关键词 : 大肠杆菌融合质粒 TnAs1 IS26 接合型质粒共整合质粒多样性

8. 链霉菌质粒复制与接合转移的研究

[学位论文] 曾阿娜中国科学院上海生命科学研究院 2009年博士导师: 覃重军共128页

摘要 : 链霉菌中除了存在环型质粒外，与大多数细菌不同的是，还存在线型结构的染色体和质粒。为了研究线型质粒在复制和接合转移方面是否与环型质粒不同，这里，我们一方面利用模式菌株——天蓝色链霉菌A3(2)中巨大的线型质粒SCP1为材料在前人的基础上深入研... 展开链霉菌中除了存在环型质粒外，与大多数细菌不同的是，还存在线型结构的染色体和质粒。为了研究线型质粒在复制和接合转移方面是否与环型质粒不同，这里，我们一方面利用模式菌株——天蓝色链霉菌A3(2)中巨大的线型质粒SCP1为材料在前人的基础上深入研究其复制的分子机理，另一方面以线型质粒SAP1和pFRL1为对象鉴定质粒接合转移的关键基因；此外，为了比较，我们还研究了环型质粒pFP1和pFP11的接合转移等。具体内容包括：一、链霉菌线型质粒SCP1上三个复制位点的研究。SCP1是天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)A3(2)内源的一个365，023 bp的巨大线型质粒。本研究在前人鉴定的一段5.4 kb DNA复制序列的基础上，深入地开展了该位点复制的分子机理的研究。RT-PCR转录分析显示，文献中预测该段序列里的非典型的链霉菌基因SCP1.195其实并不进行转录，而另一个基因SCP1.198是转录的；此外，转录方向相同的基因SCP1.196、SCP1.197和SCP1.198共同转录在一个操纵子单元里。利用链霉菌复制子探针载体pQC156构建了一系列的亚克隆，鉴定了SCP1复制所需基本元件为SCP1.196(命名为rep1A)和一段富含AT以及正向/反向重复的序列(iteron)——被一段约1.2 kb的非编码区隔开。系统的体外凝胶阻滞实验(EMSA)显示，极少量的Rep1A蛋白与双链iteron DNA序列可以很强地和特异性地结合。进一步的DNA足印(footprinting)试验表明Rep1A蛋白可以结合到几乎全部的iteron序列，暗示形成了一个大的、紧密的蛋白-DNA复合体(阻止了DNaseI的降解)。酵母双杂交试验的结果显示，Rep1A蛋白自身有相互作用。此外，本研究发现了在SCP1上还存在另外二个复制位点，其中一个位点包括一段0.6 kb的非编码区和复制基因SCP1.158(命名为rep2A)，另一个位点包括一段1 kb的非编码区和复制基因SCP1.85(命名为rep3A)。这是首次在链霉菌一个线型质粒上发现三个可以自主复制的不同的基因。二、环型质粒pFP11和pFP1接合转移的研究。本室在链霉菌中检测、克隆和测序了两个大的环型质粒pFP1和pFP11，分别为39360 bp和35139 bp。在这两个质粒上均含有链霉菌保守的、主要的接合转移基因traB(编码SpoⅢE/FtsK样的蛋白)，此外还共存有一个细菌中保守的接合转移基因traA(编码缺刻/松弛酶)。利用PCR打靶的方法将traB精确敲除后，质粒在变铅青链霉菌中的转移能力从100％下降到0，证实了该基因为主要的接合转移基因。基因traA单独存在的质粒未能在变铅青链霉菌中检测到接合转移，暗示该基因可能不能单独发挥功能。纯化的TraA蛋白在体外也不能“缺刻”双链环型DNA，支持了以上的假设。三、线型质粒SAP1和pFRL1接合转移的研究。对线型质粒pFRL1和SAP1的序列进行分析发现，这两个质粒中均存在与环型质粒主要的接合转移基因traB同源的基因，含有典型的负责DNA转移的SpoⅢE/FtsK结构域。克隆有这些基因的非接合性环型质粒载体，可以在变铅青链霉菌中进行高频的接合转移。敲除traB基因的质粒完全失去接合转移的能力，而单独缺失邻近的基因可使接合转移的频率降低103-105，表明traB基因是主要的负责接合转移的基因，邻近的基因也是高效接合转移所需要的。同时也暗示线型质粒与环型质粒的接合转移可能有相似的机制。四、天蓝色链霉菌染色体上与线型质粒同源的基因(SCO4127)影响发育分化。生物信息学分析显示，天蓝色链霉菌A3(2)染色体上基因SCO4127与线型质粒SLP2接合转移所必需的一个基因有同源性，该基因编码一个ATP/GTP结合蛋白，与细菌接合转移Ⅳ型分泌系统中VB4蛋白也有很高的同源性。定点敲除该基因后发现该突变体气生产孢受到影响，表明SCO4127参与了链霉菌孢子的发育分化过程。SCO4126-4131也在同一个转录单元内，敲除SCO4126-4131的突变体与单独敲除SCO4127有类似的表型。将4个可以高频接合转移的链霉菌环型质粒入这两个突变体中，检测其接合转移频率，发现跟野生型相比并没有明显变化，表明这些基因的缺失不影响环型质粒的接合转移。收起

关键词 : 链霉菌线型质粒复制环型质粒接合转移

9. IncA和IncC多重耐药质粒的基因组进化与传播

[学位论文] 孔娜安徽大学 2020年硕士导师: 梁龙共99页

摘要 : IncA、IncC质粒是细菌重要的可移动遗传元件(MGEs)，可以通过接合介导遗传物质在不同种属细菌间进行基因水平转移(HGT)。现在由于多药耐药超级细菌的出现，给人类公共卫生健康造成了巨大的威胁。而IncA、IncC质粒的进化、扩散对细菌耐药表型的产生传播... 展开 IncA、IncC质粒是细菌重要的可移动遗传元件(MGEs)，可以通过接合介导遗传物质在不同种属细菌间进行基因水平转移(HGT)。现在由于多药耐药超级细菌的出现，给人类公共卫生健康造成了巨大的威胁。而IncA、IncC质粒的进化、扩散对细菌耐药表型的产生传播起到至关重要的作用。作为众多耐药基因的载体，IncA、IncC质粒的进化变异以及在菌株间的扩散传播与病原耐药表型的扩散密切相关。因此，为了更有效的应对IncA、IncC多重耐药质粒的基因组进化与传播带来的潜在威胁，为了更准确的防控质粒的传播扩散，为了延缓现有抗菌药的使用寿命，对IncA、IncC质粒的基因组进化、传播扩散规律展开了系统的研究。 IncA、IncC质粒的分型在研究中一直存在分歧，而正确的分型对于质粒的系统研究非常重要，所以本文的第一部分工作对IncA、IncC质粒的分型进行了探究。搜集了279个质粒，其中IncA质粒6个。通过对279个质粒的复制子、进入排斥基因分析得到了IncA、IncC质粒是相容且排斥的原因；利用IncC质粒的特征区域片段的探究分析把271个IncC质粒分为四种类型。对参考质粒和不同类型质粒的耐药岛进行了比对分析和统计。在IncC质粒中发现了大量的抗生素耐药基因聚集IncC骨架中的各种辅助模块中。IncC质粒包含至少三个整合blaCMY携带区的热点和两个命名为ARI-A和ARI-B的抗生素耐药岛。blaCMY携带区和ARI-A经常在1型质粒中发现，但在2型质粒中不常见，1型和2型质粒都携带ARI-B，但出现频率不高。第二部分研究工作将IncA、IncC多重耐药质粒类群/家族视为一个“物种”来研究，创造性的将细菌比较基因组学，系统发育学，分子进化等研究方法引入，探究IncA、IncC质粒的进化动态，还原其进化历程，深入认识IncA、IncC质粒的演化和传播。首先建立了质粒的泛基因组模型，结合同源搜索得到了44个核心基因，以核心基因为研究对象建立系统地理发生学模型和全球传播网络。结果发现IncA、IncC质粒的不同类型分别拥各自进化过程和遗传特征。结合不同类型质粒核心基因的密码子偏性分析，正选择压力分析、重组分析以及氨基酸进化速率分析，提出了IncA、IncC多重耐药质粒存在这样一种“全球传播，区域性进化”的传播进化模式。本文广泛收集、获取目前所有的IncA、IncC质粒基因组，充分利用现有数据，采取泛基因组模型、系统发生、分子进化、系统发生地理学等分析手段，全面构建其遗传进化关系。并确定IncA、IncC质粒在传播过程中的发生的微进化事件如重组、选择等。完整追踪IncA、IncC质粒家族起源关系、演化历程、时空传播动态等。进而还原IncA、IncC基因组的全部进化历程。深入全面阐明该型多重耐药质粒的进化规律和传播扩散机制，对防控细菌耐药性的传播扩散有着重要指导意义。收起

关键词 : 多药耐药细菌 IncA质粒 IncC质粒基因进化传播扩散规律

10. 致泻大肠埃希氏菌质粒DNA定性标准物质的研制及在枸杞子检测中的应用

[学位论文] 夏丹丹河南大学 2020年硕士导师: 马常阳;于秀华共75页

摘要 : 核酸标准样品是指核酸扩增技术中使用的标准样品，对促进致病性核酸扩增检测方法的标准化，提高检测结果的一致性和准确性具有重要作用。我国在核酸标准样品的研制方面刚刚起步，数量和种类也远远不能满足当前市场及监督检验的需求。大肠杆菌是全世界... 展开核酸标准样品是指核酸扩增技术中使用的标准样品，对促进致病性核酸扩增检测方法的标准化，提高检测结果的一致性和准确性具有重要作用。我国在核酸标准样品的研制方面刚刚起步，数量和种类也远远不能满足当前市场及监督检验的需求。大肠杆菌是全世界范围内常见的致病菌，目前仍缺少其毒力基因监测相关质粒DNA标准样品，因此本研究将以此为目标开展。本文通过对大肠杆菌中常见毒力基因escV、stx2、hlyA、rfb、uid和eaeA引物进行PCR扩增，分别得到其扩增产物，通过琼脂糖凝胶纯化目的基因片段，克隆至载体pLB-simpleVector中，构建含目的基因片段的重组质粒；通过菌落PCR和测序对重组质粒进行验证，菌落PCR结果显示转化成功率为100%，将测序结果与GenBank上已公布的基因序列进行比对，结果除了uid重组质粒比对率为99.6%，其余测序结果比对率为100%，表明重组质粒都构建成功；建立PCR反应体系，对质粒标准品进行检测限和特异性实验，结果显示检测灵敏度可以达到pg级别，质粒标准品都具有特异性；进行传15代测序，测序结果也相同，表明构建的质粒标准品具有稳定性；选取escV、stx2、hlyA质粒标准品进行冻干粉制备，采用PCR对冻干粉进行检测限实验，检测限分别为3.93×106拷贝·μL-1、2.41×105拷贝·μL-1和2.14×105拷贝·μL-1；对escV、stx2和hlyA质粒标准品冻干粉样品进行均匀性检测，结果显示冻干粉之间不存在显著性差异，样品均匀性较好；随机取escV、stx2和hlyA质粒标准品冻干粉样品各30管置于25℃、4℃和-20℃3个温度保存，在固定时间分别取3个温度下样品进行稳定性检验，浓度测定结果表明质粒标准品冻干粉具有很好的稳定性，并通过PCR反应对冻干粉性质进行测定，PCR结果显示在3个温度下冻干粉的性质稳定；将构建的大肠杆菌常见毒力基因escV、stx2和hlyA的质粒标准品作为阳性对照，对36批枸杞子样品进行PCR检测，结果在34批样品中均没有escV、stx2被检测出，检出率为0；3批枸杞子样品中检测出hlyA，检出率为8.82%。此后选择PCR检测结果为阳性的3批枸杞子样品进行传统微生物分离鉴定，结果没有检测出大肠杆菌。传统微生物检测方法中使用的增菌液没有针对性的对目的菌进行增菌，推测在微生物污染环境下，目标致病菌的生长可能被抑制，导致检出率大大降低。本课题以食源性微生物大肠杆菌为研究对象，构建大肠杆菌中常见毒力基因的质粒DNA标准品，在大肠杆菌检测中可作为阳性对照和参考物质，并将其应用于中药枸杞的微生物检测。收起

关键词 : 埃希氏菌毒力基因重组质粒枸杞子质粒DNA