摘要: 在中药材的储存、制备等过程中会发生致病菌污染，沙门氏菌是常见的食源性微生物致病菌之一，感染后会导致中毒、呕吐、腹泻等病状，因此对沙门氏菌检测是必要的、严格的，而传统的微生物学检测方法繁琐、灵敏度低，未能达到快速检测需求。因此，利用... 展开 在中药材的储存、制备等过程中会发生致病菌污染，沙门氏菌是常见的食源性微生物致病菌之一，感染后会导致中毒、呕吐、腹泻等病状，因此对沙门氏菌检测是必要的、严格的，而传统的微生物学检测方法繁琐、灵敏度低，未能达到快速检测需求。因此，利用现代分子生物学技术,提高检测的特异性和灵敏度已经成为人们关注的热点。 本实验以沙门氏菌为研究对象，根据国标及文献中沙门氏菌常见毒力基因invA、fimI、mgtC和fimA，分别设计合成了沙门氏菌毒力基因invA、fimI、mgtC和fimA的4对引物。提取鼠伤寒沙门氏菌CMCC50071、鼠伤寒沙门氏菌CMCC50115、鼠伤寒沙门氏菌ATCC14028、肠炎沙门氏菌CICC21482、沙门氏菌CMCC50956、沙门氏菌CMCC50957、沙门氏菌CMCC50958、以及沙门氏菌CMCC50959的全基因组DNA；以提取的沙门氏菌菌株的全基因组DNA为模板，PCR扩增，分别得到invA、fimI、mgtC和fimAPCR扩增产物，通过琼脂糖凝胶对目的产物invA、fimI、mgtC和fimA的分离纯化，并分别将纯化过的目的片段invA、fimI、mgtC和fimA进行连接与转化，克隆到载体pLB-simpleVector中，构建含invA、fimI、mgtC和fimA目的片段的重组质粒DNA；利用菌落PCR和测序对重组质粒进行验证，经验证转化成功的重组质粒进行质粒提取并保存，将其进行冻干制成冻干粉，用于检测沙门氏菌的标准品。结果成功构建出毒力基因invA、fimI的重组质粒，进行均一性，随机性，稳定性检测，结果表明浓度、纯度和稳定性均达到要求，从而完成对沙门氏菌毒力基因质粒定性标准品的制备。 本实验采用来自河南焦作四大怀药，共81批次，其中怀菊花23批，怀山药18批，怀地黄20批，怀牛膝20批，提取81批四大怀药的全基因组DNA，进行PCR扩增，用沙门氏菌常见毒力基因invA、fimI质粒DNA标准品做阳性对照，以无菌水做阴性对照，用于81批怀药样品的检测，实验结果显示，结果在81批样品中fimI没有被检测出，检出率为0，有2批菊花样品检测出invA，检出率为8.69%，1批地黄样品中检测出invA，检出率为5.00%，选择被污染的菊花和地黄样品，用传统微生物检测方法进行检测，样品经过增菌培养后，在选择性显色培养基平板上第8批次地黄样品、第15批次菊花样品不长菌落，第7批次菊花在选择性平板上长出了沙门氏菌的典型菌落形态，选取纯化的单菌落进行PCR扩增16SrRNA送测序比对，从而完成对81批次怀药中沙门氏菌的研究应用。与传统方法相比，PCR检测效率更高，耗时更短。本研究以食源性微生物沙门氏菌为研究对象，构建沙门氏菌中常见毒力基因的质粒DNA标准品并将其用到中药中进行检测，提供了一种临床上可以应用的技术和质粒标准品，也为临床上溯源提供了帮助。 收起