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1. Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义

[学位论文] 敖然中国医科大学 2008年博士导师: 张道荣共65页

摘要 : 目的: Pin1是一独特的肽基脯氨酰顺反异构酶，可特异性催化已磷酸化的丝（苏）脯氨酰基序发生顺反异构，从而导致蛋白活性、蛋白间相互作用、蛋白的亚细胞定位及稳定性发生变化。研究显示Pin1在人类多种肿瘤中过表达，是多个致癌信号通路的关键效... 展开目的: Pin1是一独特的肽基脯氨酰顺反异构酶，可特异性催化已磷酸化的丝（苏）脯氨酰基序发生顺反异构，从而导致蛋白活性、蛋白间相互作用、蛋白的亚细胞定位及稳定性发生变化。研究显示Pin1在人类多种肿瘤中过表达，是多个致癌信号通路的关键效应分子。Pin1的过表达和肿瘤的关系越来越引起人们的关注。 β-连环素(β-catenin)是上皮钙黏素-连环素复合体(E-cadherin/catenin)和Wnt信号传导通路的关键分子，当β-连环素在细胞核内蓄积时，能激活Wnt信号传导通路，启动c-myc、cyclin D1等靶基因转录，导致细胞增殖、侵袭和转移。CyclinD1是细胞增殖周期从G1期到S期的关键蛋白，CyclinD1在G1期到S期的转变中起关键的正向调节作用，因而又被称为原癌基因。细胞周期失控是细胞增殖癌变的重要原因。 WULF等研究证明，在乳腺癌中，可以检测到Pin1、β-catenin与CyclinD1的过度表达;也有文献指出，在直肠癌和甲状腺癌中可分别检测到Pin1与β-catenin、Pin1与CyclinD1过度表达，并且两者的过表达有相关性。本实验通过免疫组化、Western-blot、RT-PCR、免疫荧光及免疫共沉淀的方法来检测Pin1、β-catenin与CyclinD1在肝癌中的表达及意义。材料与方法: 一、.材料 24例肝癌及其癌旁正常组织标本均来自中国医科大学附属第一临床医院普外科2005年5月至2007年9月手术切除标本及存档蜡块。其中12例肝癌及其正常癌旁组织新鲜标本冷冻于-80℃冰箱用于Western-blot。人肝癌Be17402细胞株来源于中国医科大学遗传教研室。二、主要试剂和来源实验药品:浓缩型免抗人Pin1多克隆抗体、即用型CyclinD1单克隆抗体、梯度蛋白标准均购自美国Santa Cruze公司;即用型S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、β-action一抗和浓缩型辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。三、质粒及引物 Pin1的质粒由大连宝生物公司合成并鉴定，β-catenin及CyclinD1的引物由上海生工技术有限公司合成。四、方法（一）免疫组织化学染色:检测Pin1、β-catenin与CyclinD1的表达采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化（S-P法）。（二）Western-blot检测取新鲜样品（1-2克）加5倍裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。结果判定为转印膜上出现清晰的棕色条带。（三） RT-PCR PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，并以EB染色后，采用Gel Doc1000成像系统(Bio2Rad，USA)进行图像扫描和分析。mRNA含量的计算:用图像分析仪对电泳结果进行扫描，测定各条带的A值，将样本条带的积分A值与相应的β-actin mRNA条带的A值相比较，即为样本mRNA的相对含量。（四）细胞培养和转染:将bel细胞传代后置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中常规培养，根据细胞生长情况天换液1次，细胞长满后用0.25％胰蛋白酶消化传代，当细胞生长稳定、呈对数生长时进行实验（五）免疫荧光:将对数生长期的细胞转染48小时后，用蛋白酶消化，接种于置有消毒盖玻片的孔培养板内，进行免疫共荧光检测。（六）免疫共沉淀:用琼脂糖珠法收集裂解细胞蛋白，取上清跑电泳。在19kD和34kD处出现清晰条带，即为有免疫复合物沉淀。统计学方法用SPSS11统计软件包进行统计分析。采用X2检验，确切概率法和相关分析，以P＜0.05为有统计学意义。结果: 一、免疫组化结果: Pin1在癌旁正常组织中不表达或呈微弱的核表达。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。CyclinD1在癌旁正常组织中不表达。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。 β-catenin在癌旁正常组织中阳性表达定位于细胞膜，胞浆中极少。在肝癌细胞的胞浆和/或胞核内呈异位表达。二、Western-blot结果 Pin1、 CyclinD1和β-catenin在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。三、RT-PCR结果 Pin1、 CyclinD1和β-catenin mRNA在肝癌细胞株中的表达明显高于癌旁正常组织。四、免疫沉淀结果电泳结果显示在19KD和34KD处见到清晰的条带。五、免疫共荧光结果 Pin1在肝癌细胞细胞膜、胞浆及核内显色（绿色荧光）;β-catenin在肝细胞胞浆内呈显色。 CyclinD1在肝癌细胞胞浆中显色。结论: 1.Pin1、β-catenin和CyclinD1在肝癌组织中的表达明显高于相应的癌旁组织。 2.Pin1、β-catenin和CyclinD1在肝癌组织中的表达与分化、分期等病理学参数无显著相关。 3.Pin1、β-catenin和CyclinD1在肝癌组织中的表达显著正相关。 4.Pin1可能通过β-catenin来调节CyclinD1的表达。收起

关键词 : 肝癌免疫组化 &beta -连环素相关性

2. TSG101、P21<'WAF1/CIPI>及P300/CBP在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义

[学位论文] 陆平中国医科大学 2007年硕士导师: 张道荣共52页

摘要 : 本实验通过免疫组化和Western Blotting方法检测TSG101和P300/CBP及P21... 展开本实验通过免疫组化和Western Blotting方法检测TSG101和P300/CBP及P21鼠抗人单克隆抗体工作液(MAB-0235)，即用型S-P超敏免疫组化试剂盒(SP-900/9001/9002)均购自福建迈新生物技术有限公司，梯度蛋白标准(#SM0441)购自MBI公司，P300/CBPAb-1(cloneNM11)浓缩型鼠抗人单克隆抗体购自Neomarkers公司。 3、方法 (1)免疫组织化学染色检测TSG101、P21蛋白定位于癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内，P300/CBP蛋白定位于癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内，部分呈核-浆型。参考姚广裕等免疫组化评分标准，每张切片在400倍镜下观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计500个细胞。阳性细胞数≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，>75％为4分；再按染色强度评分：无色为0，淡色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；最后按照乘积分数分为4个等级：“-”(0,1,2)，“+”(3,4)“++”(6,8)“+++”(9,12)。 TSG101染色结果判定：分数≥3定为阳性，<3为阴性。 P21表达的关系，采用t检验分析Western Blot图像灰度值，P<0.05为有非常显著性差异。结果 1、TSG101在肺鳞癌、肺腺癌和正常肺组织中的表达。 TSG101在肺鳞癌和肺腺癌组织中有表达，主要定位于癌细胞的细胞浆和(或)细胞核。TSG101在正常肺组织强表达。 Western Blot结果显示：TSG101在26例肺癌组织和26例正常肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显低于相应的正常肺组织(t=8.578，P=0.000)。 2、P21蛋白定位于肺鳞癌和肺腺癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内。 3、P300/CBP在肺鳞癌、肺腺癌和正常肺组织中的表达。 P300/CBP蛋白定位于肺鳞癌和肺腺癌细胞核内和支气管粘膜上皮细胞核内，部分呈核——浆型。 4、TSG101、P21表达率为60.76％(48/79)，而且高-中分化肺癌组织的表达明显高于低分化肺癌组织(P=0.0158)；有淋巴结转移的组织明显低于无淋巴结转移的组织(P=0.0032)。Ⅰ,Ⅱ期表达明显高于Ⅲ,Ⅳ期(P=0.0026)但是P21水平呈正相关(r=0.710，p=0.000)P300/CBP和P21的表达呈正相关，TSG101基因及其在多种人类肿瘤及正常组织中发生的异常剪接在人类肿瘤发生中的作用仍备受关注，该基因作为新的抑癌候选者，其剪接变异体在肿瘤发生发展过程中的变化规律及其作用的阐释必将为人类肿瘤的发生机制及早期筛查提供重要线索，为肿瘤的防治工作带来新的契机。结论 1、TSG101在肺癌中的表达显著低于正常肺组织，在肺鳞癌，腺癌组织中，随分化水平的降低表达水平下调。 2、TSG101、P21，TSG101和P300/CBP的表达水平呈正相关。 3、TSG101、P21和P300/CBP与TNM分期差异有意义。收起

关键词 : 肺肿瘤蛋白表达肿瘤发生机制 TSG101蛋白细胞周期抑制剂抑制因子

3. 脆性组氨酸三联体在非小细胞肺癌中的表达及意义

[学位论文] 侯兴华中国医科大学 2003年硕士导师: 张道荣共51页

摘要 : 肺癌的发生是一个多基因参与、多阶段发展的复杂过程,是环境因素与基因交互作用的结果.机体暴露于环境危险因素而导致DNA损伤,促使癌基因激活和/或抑癌基因失活而形成恶性肿瘤.脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad,FHIT)基因是近年克隆的一个新... 展开

关键词 : 非小细胞肺癌 FHIT蛋白免疫组织化学免疫蛋白印迹

4. Pin1与β-catenin在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义

[学位论文] 曹薇中国医科大学 2006年硕士导师: 张道荣共44页

摘要 : 前言蛋白质序列中的丝氨酸/苏氨酸—脯氨酰键的磷酸化，是控制细胞周期循环、调节细胞增殖和分化的关键性信号调节机制。肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1是肽基脯氨酰异构酶家族成员之一，它能使蛋白质中磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酰键异构化，由顺式... 展开前言蛋白质序列中的丝氨酸/苏氨酸—脯氨酰键的磷酸化，是控制细胞周期循环、调节细胞增殖和分化的关键性信号调节机制。肽基脯氨酰顺反异构酶Pin1是肽基脯氨酰异构酶家族成员之一，它能使蛋白质中磷酸化的丝氨酸/苏氨酸-脯氨酰键异构化，由顺式变为反式，调节磷酸化蛋白质活性。β-连环素(β-catenin)同时是Wnt(wingless/int)信号转导通路和上皮钙黏连素-连环素复合体(E-cadherin/catenin)的关键分子。过度表达的Pin1可以使β-catenin在细胞核内蓄积，启动靶基因转录，如c-Myc、cyclinD1(周期素D1)等，导致细胞增殖。近来发现在多种人类恶性肿瘤中，有Pin1的过度表达和β-catenin的异常蓄积。可见Pin1和β-catenin在肿瘤发生、发展中发挥重要作用。研究肿瘤组织中Pin1和β-catenin表达情况及临床应用对肺癌发生、发展机制的研究及肺癌的治疗有重要意义。目前，关于Pin1与肺癌的关系及Pin1与β-catenin在肺癌中表达的相关性研究，国内外报道尚少。为此，本实验检测了Pin1和β-catenin在肺鳞癌和肺腺癌组织中的表达情况，分析了Pin1与β-catenin表达的相关性，初步探讨了Pin1在肺癌发生、发展过程中的作用，为阐明肺癌发生机制和寻找治疗肺癌的方法提供依据。材料与方法 1.材料收集69例肺癌组织(鳞癌45例，腺癌24例)。其中49例肺癌组织取自辽宁省肿瘤医院1980-2001年手术切除存档蜡块。另外20例新鲜肺癌组织及10例新鲜癌旁正常肺组织取自中国医科大学附属第一临床医院胸外科2005年3月-2005年7月手术切除标本。 2.主要试剂和来源实验药品：浓缩型兔抗人Pin1多克隆抗体(SC-15340)、浓缩型辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG二抗(ZB-2305)、浓缩型辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗(ZB-2301)、梯度蛋白标准(P7708V)均购自美国SantaCruz公司；浓缩型小鼠抗人β-catenin单克隆抗体(ZM-0442)购自美国Zymed公司；即用型S-P超敏免疫组化试剂盒(SP-9000)、DAB显色试剂盒(ZLI-9032)均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。 3.方法 3.1免疫组织化学染色：检测Pin1和β-catenin表达，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)。结果判定：细胞内呈现棕黄色细小颗粒者为阳性染色。每张切片在400倍镜下观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计500个细胞。Pin1染色结果的判断标准：Pin1正常不表达或弱表达于细胞核，过度表达于细胞核和(或)细胞浆。阳性细胞数分级：≤25％为0，25％-50％为1，51％-75％为2，≥75％为3；染色强度分级：无着色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；最后判断标准为上述两项得分相乘，得分≥3分为过度表达。β-catenin染色结果的判断标准：β-catenin正常表达于细胞膜，异常蓄积于细胞核和(或)细胞浆。≥10％细胞出现细胞核和(或)细胞浆阳性表达为异位表达；＞70％细胞出现细胞膜阳性表达为正常表达，反之表达减弱或缺失。异位表达及膜表达减弱或缺失均称为异常蓄积。 3.2WesternBlot：检测Pin1和β-catenin在肺癌组织和正常肺组织中的表达。取新鲜样品(1-2克)加5倍裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。结果判定为转印膜上出现棕色蛋白条带，并测定蛋白条带的灰度值。 4.统计学分析应用SPSS10.0统计软件进行数据处理，采用确切概率x2检验分析各组计数资料，采用Spearman等级相关分析Pin1与β-catenin表达的关系，采用t检验分析Westernblot图象灰度值，P＜0.05为有非常显著性差异。结果 1.Pin1在肺鳞癌、肺腺癌和正常肺组织中的表达。 Pin1在肺鳞癌和肺腺癌组织中过度表达，主要定位在癌细胞的细胞核和(或)细胞浆。Pin1在正常肺组织中不表达或弱表达于细胞核。 WesternBlot结果显示：Pin1在20例肺癌组织和10例正常肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显高于相应的正常肺组织(t=15.84，P=0.0000)。 2.β-catenin在肺鳞癌、肺腺癌和正常肺组织中的表达 β-catenin在肺鳞癌和肺腺癌组织中异常蓄积，即：主要定位在癌细胞的细胞核和(或)细胞浆；而极少定位在细胞膜。 WesternBlot结果显示：β-catenin在20例肺癌组织和10例正常肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显高于相应的正常肺组织(t=13.65，P=0.0000)。 3.Pin1、β-catenin蛋白的表达与肺鳞癌、肺腺癌的临床病理学参数的关系。 69例肺癌组织中，Pin1过度表达率为78.3％(54/69)，其中同时做WesternBlot分析的20例肺癌组织中，Pin1过度表达率为75％(15/20)。但是，Pin1表达水平与患者的性别(P=0.5358)、年龄(P=0.0836)、肺癌组织学分型(P=0.4557)、肺癌分化程度(P=0.6945)、有无淋巴结转移(P=0.6645)和TNM分期(P=0.7783)等肺癌的临床病理学参数无显著相关。69例肺癌组织中，β-catenin异常蓄积率为63.8％(44/69)，并且同时做WesternBlot分析的20例肺癌组织中，β-catenin异常蓄积率为80％(16/20)。而且，低分化肺癌组织中β-catenin异常蓄积程度明显高于中、高分化的组织(P=0.0223)；有淋巴结转移的组织明显高于无淋巴结转移的组织(P=0.0164)。但是，β-catenin异常蓄积水平与患者的性别(P=0.2151)、年龄(P=0.2269)、肺癌组织学分型(P=0.3726)、TNM分期(P=0.2818)无显著相关。肺癌组织中，Pin1和β-catenin水平呈正相关(r=0.447，P=0.0021)。讨论蛋白质序列中的丝氨酸/苏氨酸—脯氨酰键的磷酸化是控制细胞周期循环的关键性信号调节机制。Pin1使磷酸化的丝氨酸/苏氨酸—脯氨酰键异构化，由顺式变为反式，调节磷酸化蛋白质活性，对人类恶性肿瘤的发生、发展具有重要作用。我们实验结果显示，Pin1在肺鳞癌和肺腺癌组织中过度表达，且其在肺癌组织中的表达水平明显高于正常肺组织。但Pin1在肺癌组织中的表达水平与患者的性别、年龄、肺癌组织学分型、肺癌分化程度、有无淋巴结转移和TNM分期无显著相关。Wulf等研究表明，Pin1在乳腺癌和前列腺癌中过度表达，而且Pin1的表达水平与乳腺癌的临床分期显著相关，并能预测前列腺癌复发的危险性。所以，我们认为这可能是由于Pin1在不同肿瘤的进展过程中发挥不同作用所致。即Pin1可能在肺癌发生的早期阶段就发挥作用，但对肺癌的侵袭和转移影响不显著。由于Pin1敲除后可诱导肿瘤细胞凋亡，提示，抑制Pin1的表达可能成为最新的肺癌治疗方法。AkihideRyo等研究表明，乳腺癌细胞内，由于高表达E2F可增强Pin1的表达活性和mRNA含量，E2F失控上调是乳腺癌细胞促进Pin1上调的关键因素。由于E2F/Rb通路异常也是包括肺癌在内的其它肿瘤发生发展过程中的重要环节，因此可以推断在肺癌发生发展过程中，E2F/Rb通路异常可能同样引起Pin1的过度表达。 β-catenin同时是Wnt信号转导通路和上皮钙黏连素-连环素复合体的关键分子。目前，在许多肿瘤研究中已发现β-catenin的异常蓄积，而且其异常蓄积程度与肿瘤发生、发展、浸润、转移相关。我们实验结果显示，β-catenin在肺癌组织中异常蓄积，且β-catenin在肺癌组织中的水平明显高于正常肺组织。而且，β-catenin的异常蓄积与肺癌的分化程度、淋巴结转移显著相关。关于β-catenin异常蓄积的原因，目前的看法主要是其降解减缓，而非生成增加。我们实验结果显示，在44例β-catenin异常蓄积的肺癌组织中，有40例(90.9％)出现了Pin1的过度表达，而且Pin1过度表达的水平与β-catenin异常蓄积的程度呈显著正相关。AkihideRyo等研究表明，Pin1能与β-catenin第246位磷酸化的丝氨酸—脯氨酰键结合并使其异构化，阻止β-catenin与APC的相互作用，导致β-catenin在细胞内蓄积，致使在乳腺癌中，Pin1的过度表达与β-catenin的水平呈正相关。所以，我们认为在肺癌组织中，过度表达的Pin1可能对β-catenin的细胞内蓄积有上调作用，进而促进肿瘤细胞的增殖。结论 1.Pin1在肺癌组织中过度表达并且与肺癌的发生密切相关。 2.在肺癌发生过程中，Pin1和β-catenin关系密切，即Pin1和β-catenin的表达水平呈正相关。收起

关键词 : 肺鳞癌肺腺癌肽基脯氨酰顺反异构酶 &beta -连环素基因表达

5. ILK与E-cadherin在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义

[学位论文] 石蕊中国医科大学 2005年硕士导师: 张道荣共44页

摘要 : 　　肿瘤的形成与发展是一个多基因、多步骤、多阶段的病理过程，而整合素连接激酶(ILK)作为一种丝/苏氨酸蛋白激酶是多种致瘤相关因素的上游交叉点，它通过与整合素、糖原合酶-3(GSK-3)、蛋白激酶B(PKB)、表皮钙粘素等多种肿瘤相关因子作用，在细胞粘... 展开

关键词 : 肺鳞癌肺腺癌整合素连接激酶上皮钙粘素

6. TSG101在肺鳞癌、肺腺癌组织中的表达及其与MDM2的相关性研究

[学位论文] 高艳华中国医科大学 2007年硕士导师: 张道荣共42页

摘要 : 肿瘤易感基因101(tumour susceptibility gene101)是一个潜在的肿瘤抑制基因，定位于11P15.1-15.2。TSG101蛋白包括N-端为泛素连接酶E2样结构域、脯氨酸富集区(人TSG101第130-205个氨基酸处)和C-端螺旋卷曲结构域(人TSG101第231-302个氨基酸处)及一个... 展开肿瘤易感基因101(tumour susceptibility gene101)是一个潜在的肿瘤抑制基因，定位于11P15.1-15.2。TSG101蛋白包括N-端为泛素连接酶E2样结构域、脯氨酸富集区(人TSG101第130-205个氨基酸处)和C-端螺旋卷曲结构域(人TSG101第231-302个氨基酸处)及一个稳定盒SB(steadiness box domain)控制其稳定水平。TSG101基因与细胞生长密切相关，细胞中TSG101含量不足或过量均能引起细胞转化或细胞周期紊乱。TSG101的N末端含有一个泛素连接酶催化区UBC，但缺乏其活性作用位点处的半胱氨酸(被酪氨酸取代)，经研究证实TSG101是泛素连接酶的转录抑制子，但只有保留有螺旋卷曲结构的TSG101蛋白质才能够作为转录抑制因子调控转录活性。TSG101作为转录抑制因子，其主要的靶基因为MDM2基因，在此抑制作用中，TSG101通过其UBC区影响MDM2的泛素连接酶催化区，与MDM2形成独自的反馈控制环，通过影响MDM2的稳定性参与MDM2蛋白的降解，而TSG101降解反过来受MDM2的调节。此作用提示TSG101可能与MDM2蛋白一起参与肿瘤的发生。目的本实验通过研究TSG101在肺鳞癌、肺腺癌组织的表达及其与肺癌的临床分期、分化程度、组织学分型及淋巴结转移等临床病理资料的关系以及与MDM2相关性的研究，进一步分析。FSG101和MDM2参与肺癌发生、发展的可能机制。材料与方法 1、材料收集79例肺癌组织(鳞癌48例，腺癌31例)，其中53例肺癌取自辽宁省肿瘤医院1980-2001年手术切除存档蜡块。另外26例新鲜肺癌组织及26例新鲜癌旁正常肺组织取自中国医科大学附属第一临床医院胸外科2006年5月-2006年7月手术切除标本。 2、主要试剂和来源浓缩型鼠抗人TSG101单克隆抗体(sc-7964)购自美国Santa Cruz公司，浓缩型辣根酶标记山羊抗小鼠(ZB-2305)，浓缩型DAB(ZLI-9302)试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。浓缩型鼠抗人MDM2单克隆抗体(sc-965)Santa．cruz公司，用于免疫组织化学染色。 3、方法 (1)免疫组织化学染色：检测TSG101和MDM2的表达，采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)。TSG101以癌细胞胞浆或胞核中出现棕黄色颗粒视为阳性染色，MDM2以癌细胞胞核或胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性染色。免疫组化评分标准为：每张切片在400倍镜下观察5个视野，每个视野计数100个肿瘤细胞，共计500个细胞；阳性细胞数≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，>75％为4分；再按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；最后按照乘积分数分为4个等级：“_”(0,1,2)，“+”(3,4)“++”(6,8)“+++”(9,12)。 TSG101免疫组化染色结果判断标准：分数≥3定为阳性，<3为阴性。 MDM2免疫组化染色结果判断标准：≥10％胞浆出现棕黄色颗粒为阳性。 (2)Western Blot：检测TSG101在肺癌组织和正常肺组织中的表达。取新鲜样品(1-2克)加5倍裂解液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检查。结果判定为转印膜上出现棕色蛋白条带，并测定蛋白条带的灰度值。 4、统计学分析应用 SPSS13.0统计软件进行数据处理，采用x收起

关键词 : 肿瘤易感基因101 MDM2基因免疫组化肺组织表达转录抑制子分化程度病理机制

7. Claudin-7与Slug在肺鳞癌和腺癌中的表达及其临床意义

[学位论文] 李锐中国医科大学 2011年硕士导师: 张道荣共41页

摘要 : 前言:Claudin-7是紧密连接蛋白Claudins的家族成员之一,参与维持细胞的极性和调节细胞间的渗透性,在食管癌和结肠癌中表达降低或缺失而在胃腺癌和卵巢癌中Claudin-7的表达较周围正常组织反而升高,但无论其表达升高还是降低都与肿瘤的发展有关。Slug是... 展开前言:Claudin-7是紧密连接蛋白Claudins的家族成员之一,参与维持细胞的极性和调节细胞间的渗透性,在食管癌和结肠癌中表达降低或缺失而在胃腺癌和卵巢癌中Claudin-7的表达较周围正常组织反而升高,但无论其表达升高还是降低都与肿瘤的发展有关。Slug是锌指转录因子Snail超家族成员之一,小鼠Slug和Snail具有高度的同源性,在N末端都含有SNAG反式转录区,C末端分别含有5个和4个锌指结构,功能获得和缺失实验表明Slug在鸡和爪蟾胚胎特定区域可以启动EMT(上皮-间质转化),并且通过与启动子上的E-box结合抑制E-cadherin、Claudin-1等其他紧密连接蛋白的转录。在脊椎动物中Snail抑制Claudin-7的转录活性不仅依赖于锌指区域,而且还依赖于N末端的SNAG反式转录区,而Slug与Snail在N末端具有高度同源性,都含有SNAG反式转录区,在人类Claudin-7启动子含有7个E-box,为Slug的结合提供了位点,那么本研究旨在初步探讨肺癌中Claudin-7和Slug的表达情况,及两者表达的可能相关性。实验材料与方法: 1、材料收集101例原发性肺癌组织(鳞癌52例,腺癌49例)和40例正常肺组织,另外30例新鲜肺癌组织及癌旁肺组织均来自中国医科大学附属第一医院2004年8月至2010年5月外科手术切除标本。 2、主要试剂浓缩型兔抗人Claudin-7多克隆抗体(34-9100)购自Invitrogen公司,兔抗人Slug多克隆抗体(bs-1382R)购自北京博奥森生物技术有限公司。 3、实验方法 (1)免疫组织化学组织标本经10%中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4gm切片。切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精脱苯、水化后,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P法)检测Claudin-7(1:200)和Slug(1:150)蛋白表达。细胞内呈现棕黄色细小颗粒者为阳性染色,每张切片在400倍镜下观察10个视野,每个视野计数100个肿瘤细胞。阳性细胞数≤10%为1分,11%-50%为2分,50%-75%为3分,≥75%为4分;再按染色强度评分:无色为0,淡色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;最后按照乘积分数分为4个等级:“-”(0,1,2),“+”(3,4),“++”(6,8),“+++”(9,12)。结果判定:分数≥3定为阳性,＜3为阴性。 (2)Western Blot 将含80μg总蛋白的组织裂解产物进行10%SDS-PAGE电泳后,50伏恒压转膜120分钟,脱脂奶粉室温封闭2h,经TTBS冲洗3次,抗Claudin-7抗体(1:300)、抗Slug抗体(1:300)和抗β-actin抗体(1:200),4℃孵育过夜后,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2h,TTBS洗三次后ECL发光。以β-actin为内对照,以β-actin为内对照,比较各条带灰度值。 4、统计分析采用SPSS13.0统计学分析软件,对Claudin-7和Slug表达与临床病理因素的关系用x2检验;Claudin-7和Slug表达的关系采用Spearman等级相关分析,采用t检验分析Western blot图像灰度值。P＜0.05为有统计学意义。结果: 1、免疫组化肺癌组织中Claudin-7的表达主要定位于细胞浆,少量定位于细胞膜和细胞核,在鳞癌和腺癌中的表达较正常肺组织明显减弱。Slug表达主要定位于细胞浆和细胞核,在鳞癌和腺癌中的表达较正常肺组织明显增高。两者表达水平均与肺癌组织分化程度、淋巴结转移明显相关,并且Slug还与TNM分期呈正相关,Claudin-7与Slug蛋白表达呈负相关。 2、Western blotClaudin-7在肺癌组织中的表达量明显低于配对癌旁肺组织,而Slug在肺癌组织的表达却显著高于癌旁肺组织。结论:在肺鳞癌和腺癌中,Claudin-7与Slug的表达变化与肿瘤的进展密切相关,是判断其生物学行为,预测转移趋势极具价值的指标。Claudin-7蛋白表达下调与Slug的高表达有关。收起

关键词 : 肺癌癌旁肺组织免疫组化细胞浆细胞核

8. ILK和PKB在肺鳞癌和腺癌中的表达及意义

[学位论文] 房晓中国医科大学 2005年博士导师: 张道荣共41页

摘要 : 前言：肺癌在世界范围内是一种主要的死亡原因，已成为严重威胁人类健康和生命的一号杀手，研究肺癌发生、进展的机理具有重要的医学和社会价值。随着现代分子生物学理论和技术的发展，人们已经认识到细胞内原癌基因的激活和抑癌基因失活是肿瘤病因学... 展开前言：肺癌在世界范围内是一种主要的死亡原因，已成为严重威胁人类健康和生命的一号杀手，研究肺癌发生、进展的机理具有重要的医学和社会价值。随着现代分子生物学理论和技术的发展，人们已经认识到细胞内原癌基因的激活和抑癌基因失活是肿瘤病因学在基因水平上的两个主要方面。近年研究发现，整合素连接激酶(integrin-linkedkinase，ILK)和蛋白激酶B(proteinkinaseB，PKB)与肿瘤的发生及生物学行为密切相关。ILK是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，具有癌基因某些特性，与整合素细胞质侧β1、β3亚单位相互作用，以磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)依赖方式活化。活化的ILK可介导细胞内多种底物磷酸化，其中重要的有PKB。活化的PKB——磷酸化PKB(p-PKB确)，通过抑制凋亡、促进肿瘤新生血管形成及细胞周期进展等作用参与调节肿瘤的发生。已经发现多种人类恶性肿瘤中，ILK和p-PKB表达升高。 ILK和PKB在肿瘤发生、侵袭和转移中具有重要作用，探讨肺癌组织中ILK和PKB的表达及其与临床病理特征的关系，对理解肺癌发生、演进的机制和判断预后具有重要意义。关于ILK与原发性肺癌关系以及ILK与PKB在肺癌表达的相关性研究，国内外未见报告。本实验通过研究ILK和PKB在肺鳞癌和腺癌组织的表达以及与肺癌临床分期、分化程度、组织学分型及淋巴结转移的关系，探讨ILK与PKB的表达与肺癌的生物学行为的关系，进一步分析ILK和PKB参与肺癌发生、发展的可能机制。实验方法：收集35例新鲜肺癌组织标本，39例肺癌石蜡标本，10例癌旁正常肺组织标本。所取新鲜标本一部分10％福尔马林固定、石蜡包埋，利用免疫组化方法检测p-PKB和ILK蛋白在肺癌及癌旁正常组织中的表达，并进行相关性分析；其余新鲜标本-70℃冻存，采用Westernblot法检测p-PKB/PKB在肺癌及癌旁正常组织中的表达；利用RT-PCR技术检测肺癌及癌旁正常组织中PKBmRNA和ILKmRNA的表达。采用卡方检验、t检验和相关分析等方法，利用SPSS软件进行统计学分析。结果一、ILK和p-PKB蛋白在肺癌组织中的表达1.ILK蛋白在74例肺癌组织中阳性表达率为74.3％，而10例正常肺组织的支气管及肺泡上皮细胞无一例呈ILK阳性表达。ILK蛋白阳性表达率在正常支气管上皮与肺癌比较，其差异有非常显著意义(p＜0.01)。ILK蛋白阳性表达率与肺癌患者的性别、年龄、肿瘤原发灶大小、组织学分型、分化程度、淋巴结转移的有无及临床分期均无明显关系(p＞0.05)。 2.p-PKB蛋白在肺癌组织中的阳性表达率为67.6％，癌旁正常肺组织未见p-PKB免疫阳性染色。在高中分化组的表达率显著高于低分化组(76.9％vs45.5％，p＜0.05)。p-PKB蛋白阳性表达率与肺癌患者的性别、年龄、肿瘤原发灶大小、组织学分型、淋巴结转移的有无及临床分期均无明显关系(p＞0.05)。二、p-PKB/PKB在肺癌组织中的表达1.p-PKB蛋白在肺癌组织和癌旁正常肺组织中的表达强度分别为59.31±4.28和13.71±1.23，两者差异显著(p＜0.05)。p-PKB蛋白在高中分化组的表达强度显著高于低分化组(p＜0.05)，与其他临床病理参数无显著相关(p＞0.05)。 2.PKB蛋白表达强度在正常肺组织与肿瘤组织之间，无显著差异(p＞0.05)。PKB蛋白的表达与肺癌组织分型、分化程度及有无淋巴结转移无明显关系(p＞0.05)。三、ILKmRNA和PKBmRNA在肺癌组织中的表达1.LKmRNA在肺癌组织的表达显著高于正常肺组织(p＜0.05)。ILKmRNA在肺癌组织的表达与组织分型、分化程度及有无淋巴结转移等临床病理参数间均无显著性差异((p＞0.05)。 2.PKBmRNA表达在正常肺组织与肿瘤组织之间，无显著差异(p＞0.05)。PKBmRNA在肺癌组织的表达与组织分型、分化程度及有无淋巴结转移等临床病理参数间均无显著性差异((p＞0.05)。四、p-PKB和ILK蛋白表达的相关性分析74例肺癌中p-PKB表达阳性的50例中有ILK阳性表达45例，pPKB阴性的24例中ILK阴性表达14例，显示p-PKB表达与ILK表达显著正相关(p＜0.05)。结论一、ILK基因及蛋白的异常表达与肺鳞癌和腺癌的发生有关，其高表达可能是肺癌发生的标志。二、肺鳞癌和腺癌中PKB基因未发生转录水平的改变，p-PKB的高表达可能是肺癌发生的早期事件。三、在肺鳞癌和腺癌发生过程中p-PKB与ILK蛋白的表达密切相关，二者的协同作用可能在肺癌发生的早期发挥重要作用。收起

关键词 : 肺肿瘤肺癌鳞癌腺癌蛋白激酶整合素连接激酶

9. 整合素连接激酶在非小细胞肺癌中的表达及意义

[学位论文] 余辉中国医科大学 2004年硕士导师: 张道荣共41页

摘要 : 肺癌是常见的恶性肿瘤之一.近年来肺癌的发病率及死亡率在包括我国在内的世界上许多国家和地区呈明显上升趋势,特别是与空气污染,吸烟有关的城市人口中,肺癌居常见肿瘤之首,而非小细胞肺癌(Non-Small Cell Lung Cancer,NSCLC)占全部肺肿瘤的80%~85%.肺... 展开

关键词 : 整合素连接激酶非小细胞肺癌免疫组织化学免疫蛋白印迹

10. Pin1与CyclinD1在肺鳞癌和肺腺癌中的表达及意义

[学位论文] 乔菊久中国医科大学 2006年硕士导师: 张道荣共40页

摘要 : 前言肿瘤的发生是在基因和基因上水平多步骤、多因素的过程，最终导致不可控制的细胞增殖、转化和死亡。在细胞增殖和转化中，主要的调节机制是由多种蛋白激酶指导的丝/苏-脯氨酸的磷酸化，如：周期素依赖激酶。蛋白中磷酸化的丝/苏-脯氨酸基序存在顺... 展开前言肿瘤的发生是在基因和基因上水平多步骤、多因素的过程，最终导致不可控制的细胞增殖、转化和死亡。在细胞增殖和转化中，主要的调节机制是由多种蛋白激酶指导的丝/苏-脯氨酸的磷酸化，如：周期素依赖激酶。蛋白中磷酸化的丝/苏-脯氨酸基序存在顺/反两种构型，这种构型的改变通常为磷酸化所抑制，但能够特异地被Pin1(人类肽基脯氨酰顺反异构酶)催化，Pin1通过与磷酸化的丝/苏-脯氨酸位点结合引起构象改变，使其活化。Pin1的催化活性引起的构象改变是在蛋白磷酸化之后，所以，这种构型的改变在催化活性、蛋白的去磷酸化、蛋白和蛋白之间的相互作用、亚细胞的定位、细胞信号转导途径和生长的调控中起着重要作用。因此，磷酸化依赖Pin1的调节机制是一个新的重要的信号转导机制。 Pin1在正常组织中表达有限，而在多种肿瘤组织中的表达则明显高于其来源的正常组织，而且这种改变与临床分期、临床预后密切相关。目前关于Pin1在肺癌组织中的表达情况及其与CyclinD1的相互关系的研究甚少，为此，本实验对肺鳞癌和肺腺癌及其癌旁正常肺组织中的Pin1和CyclinD1的表达情况进行研究，并分析二者与临床病理因素的关系，以探讨它们在肺癌发生发展中的作用与意义。材料与方法1.材料45例肺鳞癌和24例肺腺癌及癌旁正常组织来自辽宁省肿瘤医院1980年～2001年和中国医科大学附属第一临床医院胸外科2005年5月～2005年8月手术手术切除存档蜡块。组织均经4％甲醛固定，常规石蜡包埋。其中的10例肺鳞癌和10例肺腺癌及10例癌旁正常组织用于WesternBlot。 2.主要试剂和来源实验药品：浓缩型兔抗人Pin1多克隆抗体、即用型CyclinD1单克隆抗体、梯度蛋白标准均购自美国SantaCruze公司；即用型S-P超敏免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、β-action一抗和浓缩型辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG二抗均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。 3.方法3.1免疫组织化学染色：检测Pin1和CyclinD1的表达采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法(S-P法)。结果判定：(1)Pin1蛋白表达定位于细胞浆和(或)细胞核。根据其染色强度计分：无染色为0，淡黄色为1，棕黄色为2，棕褐色为3；按染色阳性细胞百分率计分：阳性细胞百分率＜25％者为0，阳性细胞百分率25％～49％者为1，阳性细胞百分率50％～74％者为2，≥75％者为3。最后判断标准为上述两项得分相乘，得分≥3分为过度表达。(2)CyclinD1蛋白表达定位于细胞浆和(或)细胞核，无明显阳性细胞为阴性(-)，阳性细胞数小于20％为弱阳性(+)，阳性细胞数大于20％为阳性(++)。其中弱阳性表达(+)归入阴性(-)中。 3.2WesternBlot：检测Pin1在正常肺组织、肺鳞癌和肺腺癌中的表达。取新鲜样品(1-2克)加5倍裂解缓冲液，剪碎、匀浆超声处理，高速低温离心提取上清蛋白，电泳，转印，经封闭后加相应的一抗、二抗及显色试剂检测。结果判定为转印膜上出现清晰的棕色条带，并对蛋白条带作灰度值测定。 4.统计学分析应用PEMS3.1医学统计软件，对Pin1和CyclinD1的表达与临床病理特征的关系用卡方检验，P≤0.05为有统计学意义。结果1.Pin1在正常肺组织、肺鳞癌和肺腺癌中的表达Pin1在癌旁正常肺组织不表达或呈微弱的核表达。在肺鳞癌和肺腺癌癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。 WesternBlot结果显示：Pin1在10例肺鳞癌和10例肺腺癌及10例癌旁肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。 2.CyclinD1在正常肺组织、肺鳞癌和肺腺癌中的表达CyclinD1正常肺组织不表达。在肺鳞癌和肺腺癌癌细胞的胞浆和/或胞核内呈阳性或强阳性表达。 WesternBlot结果显示：CyclinD1在10例肺鳞癌和10例肺腺癌及10例癌旁肺组织中有不同程度的表达，在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。 3.Pin1、CyclinD1蛋白的表达与肺鳞癌、肺腺癌的临床病理特征关系免疫组化结果显示，Pin1的表达与患者的性别、年龄、组织类型、分化、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。CyclinD1的表达与分化程度负相关(P=0.0274)，而与患者的性别、年龄、组织类型、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。Pin1和CyclinD1二者的表达呈显著正相关(P=0.0048)。讨论丝\苏-脯氨酸残基的磷酸化是调节细胞增殖和转化的主要机制。例如：信号转导通路被癌基因Neu/Ras活化的多种脯氨酸蛋白激酶激活，最终经由多种转录因子包括：E2F、c-jun/AP-1、β-catenin/TCF和NF-κB而加强CyclinD1的转录，并且CyclinD1的稳定性由后转录磷酸化位点Thr-286-pro调控。丝\苏-脯氨酸基序的结构和功能进一步为脯氨酰异构酶Pin1所调节。因此，依赖Pin1的特异磷酸化是一个新的重要的信号机制。 CyclinD1在肿瘤的发生中起关键作用，CyclinD1的敲出能够抑制Ha/Ras或c-Neu/HER2/EerB2引起的鼠的乳腺癌的发生。这些结果暗示：CyclinD1是Neu/Ras引起的肿瘤，发生机制中必不可少的下游靶点，一个重要机制是丝\苏-脯氨酸基序的磷酸化。我们已经发现Pin1在人类许多肿瘤中过表达，它的表达水平与CycinD1的水平密切相关。更为重要的是Pin1能够通过激活c-jun/AP-1、β-catenin/TCF和NF-κB转录因子而提高CyclinD1的表达水平，Pin1也可直接结合CyclinD1磷酸化的Thr286-Pro位点，并通过抑制其入浆而稳定CyclinD1。除此之外，在除去Pin1成年女性，乳腺上皮失去伴随怀孕的强增殖能力，表型和除去CyclinD1相似。最后，经由E2F的Neu/Ras信号途径加强Pin1的转录。Pin1的转录也促进Neu/Ras转染乳腺上皮的转化表型。这些结果提供了体内体外证据证实了Pin1在早期肿瘤发生中尤为重要的作用和其吸引人的抗癌靶点。本研究中，Pin1和CyclinD1在肺鳞癌和肺腺癌中过度表达，且Pin1与CyclinD1在肺癌中的表达显著正相关。我们实验证实了Pin1是Neu/Ras激活的经由CyclinD1信号转导途径中的关键因子，所以Pin1是肿瘤发生中必不可少的关键因素。结论1.Pin1在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织，CyclinD1在肺癌组织中的表达明显高于相应的癌旁正常组织。 2.Pin1的表达与患者的性别、年龄、组织类型、分化、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。CyclinD1的表达与分化程度负相关，而与患者的性别、年龄、组织类型、淋巴结转移与否等临床病理学参数无显著相关。 3.Pin1与CyclinD1在肺癌中的表达显著正相关。收起

关键词 : 肺鳞癌腺癌肽基脯氨酰顺反异构酶细胞周期素D1