中国科学技术信息研究所--国家工程技术数字图书馆

1. hsa-miRNA在皮肤黑素瘤中的表达及hsa-miRNA-21在黑素瘤细胞中的作用机制研究

[学位论文] 王焱北京协和医学院(中国医学科学院) 2008年博士导师: 孙建方共98页

摘要 : 目的：筛选在人皮肤黑素瘤中表达的已知hsa-microRNA，根据筛选结果，探讨相应的hsa-mieroRNA在该疾病中的功能，为阐明黑素瘤发病机制、寻求有效的治疗途径提供理论和实验依据。方法：采用SBC microRNA芯片技术，将6例人皮肤黑素瘤组织总RNA分... 展开目的：筛选在人皮肤黑素瘤中表达的已知hsa-microRNA，根据筛选结果，探讨相应的hsa-mieroRNA在该疾病中的功能，为阐明黑素瘤发病机制、寻求有效的治疗途径提供理论和实验依据。方法：采用SBC microRNA芯片技术，将6例人皮肤黑素瘤组织总RNA分别与9例健康人色素痣总RNA的混合物对比，筛选其中已知的468条hsa-microRNA表达情况。根据生物信息学的有关方法处理芯片实验数据，筛选出共同差异表达的候选hsa-microRNA。采用荧光实时定量PCR的方法，分别检测这6例人皮肤黑素瘤组织中的各候选hsa-microRNA的表达情况。将芯片和qPCR两种方法结论一致的候选hsa-microRNA确定为有意义的共同差异表达hsa-microRNA。检测表达差异最明显的hsa-microRNA在A375和M14细胞系中的表达情况。采用microRNA-21 inhibitor脂质体瞬时转染黑素瘤细胞系，设立对照组，并设立microRNA-21 inhibitor 90nmol/L、180 nmol/L、270 nmol/L三个浓度，分别用CCK-8试剂盒检测细胞活性变化，并分析该浓度与细胞活性之间的关系。将活性变化最明显的一组细胞系用FCM术检测细胞周期与细胞凋亡的改变，同时用RT-PCR法检测其中的BRAF和p27基因mRNA表达水平。结果：1、此6例人皮肤黑素瘤中miRNA-21明显上调表达，miRNA-320和miRNA-494明显下调表达；2、黑素瘤细胞系A375和M14中均有miRNA-21不同程度的表达；3、将miRNA-21 inhibitor转染A375和M14细胞，当抑制剂浓度为90nmol/L时，细胞活性受到明显抑制：提高抑制剂浓度，A375细胞活性受到进一步抑制，且二者之间存在相关性；4、经转染miRNA-21 inhibitor且细胞活性发生明显抑制的A375细胞，其G1期细胞比率明显增高，而S期细胞比率明显降低，细胞凋亡比率增高；5、经转染miRNA-21 inhibitor且细胞活性发生明显抑制的A375细胞中的BRAF基因和p27基因mRNA表达水平没有明显变化。结论：运用miRNA芯片技术，首次发现人皮肤黑素瘤组织中miRNA-21明显上调表达，miRNA-320和miRNA-494明显下调表达。miRNA-21在黑素瘤细胞中抑制细胞凋亡、促进细胞增殖，可能起原癌基因样的作用。miRNA-21对BRAF和p27基因的mRNA表达水平无明显影响。收起

关键词 : 皮肤黑素瘤黑素瘤细胞病理细胞学基因表达

2. Bowen病合并恶性黑素瘤附一例报告

[学位论文] 杨宪鲁遵义医学院 2008年硕士导师: 张信江共36页

摘要 : 报告1例Bowen病合并恶性黑素瘤。患者男，77岁，左侧腰部斑块10年，左中下腹黑褐色斑疹4年。左侧腰部斑块组织病理学显示棘层细胞排列紊乱，可见异型核分裂及瘤巨细胞。左中下腹皮损组织病理学显示表皮全层可见黑素细胞增生，真皮内可见淋巴样色素细胞... 展开

关键词 : Bowen 合并恶性黑素瘤

3. MAGEA1在黑素瘤转移中的作用及机制的初步研究

[学位论文] 许媛媛中国人民解放军总医院解放军医学院 2019年硕士导师: 赵华共61页

摘要 : 恶性黑素瘤(malignant melanoma)是源自黑素细胞的恶性肿瘤，在皮肤肿瘤中恶性程度最高，转移性黑素瘤患者的五年生存率不足10％。近年来，黑素瘤的发病率逐渐增加，已成为危害人类健康的严重疾病之一。黑素瘤相关抗原家族A1(MAGEA1)是MAGE-A基因亚家... 展开恶性黑素瘤(malignant melanoma)是源自黑素细胞的恶性肿瘤，在皮肤肿瘤中恶性程度最高，转移性黑素瘤患者的五年生存率不足10％。近年来，黑素瘤的发病率逐渐增加，已成为危害人类健康的严重疾病之一。黑素瘤相关抗原家族A1(MAGEA1)是MAGE-A基因亚家族的成员，亦称为癌症-种系(CG)基因或肿瘤-睾丸抗原(CTA)基因。MAGEA1在多种肿瘤中均有表达，但其内在的生物学机制尚不清楚。课题组前期对MAGEA1在黑素瘤细胞和组织中的表达及其生物学功能进行了初步探讨，发现MAGEA1在黑素瘤中表达升高，并采用体外实验证明MAGEA1可以促进黑素瘤的增殖、侵袭和迁移，但其具体的分子机制尚不明确，因此进行了进一步的研究。研究目的：通过探讨MAGEA1在黑素瘤转移中的作用及机制，深入认识黑素瘤的发生发展机制，为黑素瘤的靶向治疗提供新的思路和理论依据。研究方法： 1.免疫组化染色法检测黑素瘤和色素痣组织中MAGEA1的表达。 2.利用TCGA公共数据和课题组转录组数据分析MAGEA1与黑素瘤转移的关系及其可能的信号通路。 3.用western blot检测MAGEA1对黑素瘤上皮间充质转化的影响。 4.用双荧光素酶报告系统检测稳定表达MAGEA1细胞株中的Wnt信号通路活性，并采用western blot和激光扫描共聚焦显微镜进行验证。 5.用qRT-PCR和western blot检测Wnt信号通路中关键基因的表达情况。 6.抑制Wnt信号通路后用western blot检测EMT标志物的表达，并用transwell实验检测肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。研究结果： 1.黑素瘤和色素痣组织中MAGEA1表达呈差异性。 2.MAGEA1可能促进黑素瘤患者发生转移。 3.MAGEA1可以促进黑素瘤细胞的上皮间质转化并可能与激活Wnt/β-catenin信号通路相关。 4.抑制Wnt/β-catenin信号通路后，肿瘤细胞的上皮间质转化被抑制，黑素瘤的迁移和侵袭能力下降。研究结论： MAGEA1可以促进β-catenin进入细胞核，激活经典的Wnt信号通路，从而对上皮间质转化过程进行调控，影响黑素瘤细胞的侵袭和迁移能力。收起

关键词 : 黑素瘤黑素瘤相关抗原家族A1 Wnt信号通路肿瘤转移

4. ZBTB12与黑素瘤的相关性分析及对生存预后的影响

[学位论文] 徐文聪安徽医科大学 2022年硕士导师: 陈永锋共64页

摘要 : 背景和目的黑素瘤(melanoma)作为常见皮肤肿瘤，其危害性大，死亡率约占所有皮肤肿瘤患者72%。黑素瘤的发病率逐年上升，并且作为危害公众健康最严重的的皮肤病，对社会造成了巨大、不可估量的经济影响。黑素瘤与多种危险因素相关，尤其是日光暴... 展开背景和目的黑素瘤(melanoma)作为常见皮肤肿瘤，其危害性大，死亡率约占所有皮肤肿瘤患者72%。黑素瘤的发病率逐年上升，并且作为危害公众健康最严重的的皮肤病，对社会造成了巨大、不可估量的经济影响。黑素瘤与多种危险因素相关，尤其是日光暴晒。黑素瘤的发病机制是多因素导致的，虽然目前前人已经提出一系列的理论，但是具体的明确的发病机制尚不清楚。除却早期手术完全切除的局限性黑素瘤，尽管使用了靶向药物或免疫检查点抑制药物等，黑素瘤的治疗现况并不明朗。 ZincfingerandBTBdomaincontaining（ZBTB）是一个包含49种蛋白的超家族，大多数的ZBTB蛋白主要作为一种转录因子而发挥作用，主要表现为激活细胞调节和影响癌症的发展。ZBTB家族中多个蛋白成员在乳腺癌、白血病、肠癌等肿瘤影响了疾病的发展。有临床队列研究发现，在ER阳性的乳腺癌中ZBTB12中的chr6_31975605与ER阳性乳腺癌具有统计学显著相关性，可能与ER阳性的乳腺癌良好预后有关。而ZBTB12与黑素瘤的相关研究及对生存预后的影响，目前国内外均未见报道。本研究主要通过生物信息学方法初步分析ZBTB12与黑素瘤的相关性及对其生存预后的影响，初步探索ZBTB12在黑素瘤中生存预后的影响价值。研究方法 1.目的基因与黑素瘤相关性分析 1.1通过基因表达谱交互式分析平台（GEPIA）及肿瘤免疫数据库（TIMER）验证目的基因在黑素瘤与其他肿瘤转录表达。 1.2通过TCGA数据库下载470黑素瘤患者临床数据样本，使用R软件“maftools”软件包，对目的基因及常见突变基因的突变率可视化，并用斯皮尔曼分析法分析ZBTB12和肿瘤突变负荷（TMB），微卫星不稳定性（MSI）的可能联系。 1.3通过LinkedOmics数据库建立关于目的基因的共表达网络。 1.4通过LinkedOmics数据库建立关于目的基因的富集分析。 1.5通过上述的临床数据信息，用R软件“pRRophetic”包结合症药物敏感性基因组学(GDSC)数据库，建立目的基因与常见治疗药物的敏感性分析。 1.6通过MSigDB数据库(www.gsea-msigdb.org/gsea/login.jsp)下载缺氧基因集，使用R软件“ggstatsplot”软件包进行Spearman相关性分析验证ZBTB12与缺氧基因的联系。 2.目的基因与黑素瘤预后分析 2.1通过GEIPA数据库中的生存分析功能使目的基因对黑素瘤及其他肿瘤患者的总体生存率和无病生存率可视化。 2.2通过R软件“forestplot”软件包对目的基因分别构建单因素回归分析及多因素回归分析，并根据此建立列线图。 2.3通过R软件“ConsensusClusterPlus”软件包建立缺氧基因联合目的基因于黑素瘤中的一致性聚类分析模型。 2.4通过R软件“glmnet”软件包，创建缺氧基因联合目的基因在黑素瘤中相关的最小绝对收缩和选择算子(Lasso)回归预后模型，并预测生存预后。研究结果 1.目的基因与黑素瘤相关性分析 1.1从数据库中发现对比正常组织，ZBTB12在黑素瘤中基因转录与表达较正常组织明显升高，同时ZBTB12在大多数肿瘤中信使核糖核酸（mRNA）水平表达上调。 1.2ZBTB12在黑素瘤中体细胞突变率为0.64%，明显弱于显著突变基因如BRAF等。ZBTB12的表达与TMB评分（R=0.05，P＞0.05）和MSI评分（R=0.05，P＞0.05），无统计学意义。 1.3ZBTB12的共表达网络分析中发现10,283个基因与ZBTB12呈显正相关关系，而9,446个基因（绿点）与ZBTB12呈显负相关关系。与ZBTB12最相关的前6位基因，包括EHMT2（P=1.127e-14）、RXRB（P=4.537e-11）、ZNF496（P=9.611e-11）、C6orf134（P=4.826e-10）、IFT140（P=5.146e-10）和XPO5（P=1.006e-09）。 1.4GO分析表明ZBTB12影响黑素瘤的生物过程包括生物调节”、“代谢过程”、“对刺激的反应”、“多细胞生物过程”和“定位”等。在细胞成分中，主要与“细胞膜”、“细胞核”、“膜封闭的管腔”、“含蛋白质的复合物”和“胞质溶胶”等相关。在分子功能中，主要与“蛋白质结合”、“离子结合”、“核酸结合”、“水解酶活性”和“转移酶活性”等相关。京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路分析显示在ZBTB12主要在在核糖体、碱基切除修复、剪接体和Notch信号通路等方面相关。 1.5药物敏感性分析中发现AG-014699(P=0.010,r=-0.12)、顺铂(P=6.76e-08,r=-0.25)、博来霉素(P=0.001,r=-0.16)、帕唑帕尼(P=1.71e-08,r=-0.26)、长春瑞滨(P=8.3e-14,r=-0.34)、AS601245(P=2.38e-16,r=-0.37)与ZBTB12表达呈负相关关系。而硼替佐米(P=0.005,r=0.13)与ZBTB12表达呈正相关关系。但来他替尼（CEP-701）未见统计学意义。 1.6ZBTB12与缺氧基因相关性分析中发现，ZBTB12与PSMB4（P＜0.01），PSMB5（P＜0.01），PSMC1（P＜0.05），PSMC6（P＜0.01），PSMD3（P＜0.01），PSMD4（P＜0.01），PSMD5（P＜0.05），PSME3（P＜0.05），PSME4（P＜0.05），AJUBA（P＜0.01），ARNT（P＜0.01），CA9（P＜0.01），CREBBP（P＜0.01），EGLN1（P＜0.01），EP300（P＜0.01），EPO（P＜0.05），HIFIAN（P＜0.01），HIF3A（P＜0.01），PSMF1（P＜0.01），RPS27A（P＜0.01），UBA52（P＜0.01），VEGFA（P＜0.01），PSMF1（P＜0.01），VHL（P＜0.01）以及WTIP（P＜0.01）等呈正相关。PSMA5（P＜0.05），PSMA8（P＜0.05），PSMB1（P＜0.05），PSMB10（P＜0.01），PSMB3（P＜0.01），PSMB6（P＜0.05），PSMB8（P＜0.01），PSMB9（P＜0.01），PSMC2（P＜0.05），PSMD9（P＜0.05），PSME1（P＜0.01），PSME2（P＜0.01），EPASI（P＜0.01）和UBC（P＜0.01）等表达与ZBTB12呈负相关关系。 2.目的基因与黑素瘤预后分析 2.1ZBTB12过表达与黑素瘤患者（P=0.0028，HR=1.5）和肝细胞肝癌（P=0.002，HR=1.7）患者总体生存预后差相关。 2.2单因素Cox回归分析显示ZBTB12（P＜0.05，HR=1.17175），多因素Cox回归分析显示ZBTB12（P＜0.01，HR=1.31299），校准曲线图示1年和5年的预测数值和实际总体生存率概率基本一致。 2.3基于缺氧相关基因与ZBTB12的黑素瘤分子亚群的一致性共识聚类结果提示，分为聚类1组及聚类2组。聚类1组的整体生存率OS显着低于聚类2组（HR=1.638，P=0.0352，95%CI：1.035-2.594），具有统计学意义。 2.4Lasso回归模型示高风险组中的黑素瘤患者的预后比低风险组更差（P=3.63e-13），且时间依赖性ROC曲线的AUC以量化模型预后性能的准确性，其结果证明了有意义的预后预测价值（1年AUC=0.724，3年AUC=0.692，5年AUC=0.73）。研究结论本课题研究表明ZBTB12表达和可能的缺氧基因相关ZBTB12与黑素瘤的预后相关。生存预测模型可以准确预测黑素瘤患者的整体生存率，这可能有助于预测黑素瘤预后的个体化差异；我们发现AS601245可能有效治疗高表达ZBTB12的黑素瘤患者。ZBTB12可能是黑素瘤的潜在预后生物标志物。收起

关键词 : 黑素瘤 ZBTB12 预后转录因子

5. BAG-1在皮肤黑素瘤的表达及其对黑素瘤细胞生物学行为影响的体外研究

[学位论文] 宋亚丽北京协和医学院(中国医学科学院) 2008年博士导师: 孙建方共79页

摘要 : 恶性黑素瘤是一种高度恶性的黑素细胞肿瘤，皮肤是其主要累及部位之一。皮肤恶性黑素瘤的发病率逐年增加，其死亡例数占所有皮肤肿瘤的80％。BAG-1是一种多功能蛋白，在多种肿瘤的发生、发展及放、化疗治疗反应中有重要的生物学作用。但BAG-1蛋白在皮... 展开恶性黑素瘤是一种高度恶性的黑素细胞肿瘤，皮肤是其主要累及部位之一。皮肤恶性黑素瘤的发病率逐年增加，其死亡例数占所有皮肤肿瘤的80％。BAG-1是一种多功能蛋白，在多种肿瘤的发生、发展及放、化疗治疗反应中有重要的生物学作用。但BAG-1蛋白在皮肤黑素瘤组织中的表达情况及其临床意义尚未见报道，BAG-1在黑素瘤发生、发展中的具体作用及其机制更不清楚。目的：探讨BAG-1在皮肤黑素瘤的表达及其与临床病理特征的相关性；RNAi抑制BAG-1基因表达，研究其对小鼠黑素瘤B16F10细胞株的细胞周期、增殖、凋亡及多西紫杉醇治疗反应的影响。材料与方法：第一部分：免疫组化检测BAG-1、p53、Bcl-2在皮肤恶性黑素瘤、色素痣、正常人皮肤的表达，结合患者临床资料(性别、年龄、Clark分级等)进行分析；检测BAG-1在黑素瘤细胞株M14和B16F10细胞的表达。第二部分：以pRNAT-U6.1/Neo为载体，构建重组shRNA质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-1、-2、-3，酶切及PCR测序鉴定；利用lipofectaminTM 2000将重组质粒转染小鼠黑素瘤B16F10细胞，设阴性对照组(转染阴性对照质粒Neg)和空白对照组(未转染组)，转染48 h后，荧光显微镜下检测转染效率，G418筛选阳性克隆并扩增：用RT-PCR、western blot法分别检测BAG-1基因mRNA、蛋白的表达，筛选干扰效率最高的shRNA质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3。第三部分：分别培养空白对照组、阴性对照组细胞及转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3的细胞，流式细胞仪分析细胞周期，MTT法和平皿克隆形成实验检测细胞增殖能力，TUNEL，法检测细胞凋亡，并在显微镜下计数每500个细胞中凋亡细胞的数值； MTT法计算多西紫杉醇对B16F10细胞的增殖抑制率，进一步以多西紫杉醇10 umol/L的浓度分别处理空白对照组、阴性对照组及转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组细胞，于加药后24 h、48 h，流式细胞仪检测细胞周期，TUNEL法检测细胞凋亡。结果：第一部分：BAG-1在正常皮肤不表达，在皮肤恶性黑素瘤的阳性表达率为78％，显著高于色素痣组15％(P<0.001)，BAG-1蛋白在皮肤恶性黑素瘤中的表达与Clark分级呈正相关(r=0.47，P<0.05)。第二部分：酶切及测序结果证实重组质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-1、-2、-3构建成功。质粒在B16F10细胞的转染效率为20～30％。阴性对照组的BAG-1基因表达水平与空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)；与阴性对照及空白对照组相比，shRNA质粒转染组的BAG-1基因表达显著下降(P<0.05)，其中以pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3抑制效率最高，抑制率在mRNA和蛋白水平分别为(77±4)％和(62±2)％。第三部分：与阴性对照组及空白对照组细胞相比，转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组细胞出现以下变化：细胞周期S期细胞增多；生长速度减慢，形成的细胞克隆数值减少；凋亡细胞数值增多，差异有统计学意义(P<0.05). 多西紫杉醇10 umol/L处理后24 h，各组细胞均表现为G2期细胞百分比升高：处理后48 h，转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组的G2期细胞百分比明显高于阴性对照及空白对照组(P<0.05)。多西紫杉醇10 umol/L处理后24 h及48 h，转染pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3组凋亡细胞数值均明显高于阴性对照及空白对照组(P<0.05)。结论： BAG-1在皮肤恶性黑素瘤组织中的表达显著升高，其表达水平与Clark分级呈正相关；针对小鼠BAG-1基因的shRNA真核表达质粒pRNAT-U6.1/Neo-BAG-1-3能高效、特异地抑制小鼠黑素瘤B16F10细胞BAG-1基因的表达：干扰BAG-1基因表达能影响小鼠黑素瘤B16F10细胞的细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡及其对多西紫杉醇的治疗反应，表现为明显的S期阻滞、细胞生长速度和克隆形成能力明显降低、凋亡细胞数目显著增加、对多西紫杉醇处理所诱导的细胞周期G2期阻滞、细胞凋亡的敏感性明显增加。收起

关键词 : 皮肤黑素瘤恶性黑素瘤临床病理病理特征多西紫杉醇细胞周期细胞凋亡

6. 恶性黑素瘤中调控hTERT基因相关miRNAs的筛选与功能研究

[学位论文] 柴莉新疆医科大学 2018年博士导师: 康晓静共155页

摘要 : 目的：检测hTERT mRNA及其蛋白在恶性黑素瘤及色素痣石蜡包埋组织中的表达，分析hTERT mRNA表达与恶性黑素瘤临床病理特征及其蛋白之间的关系；预测并筛选恶性黑素瘤中调控hTERT基因的相关miRNAs ，分析候选miRNAs与hTERT mRNA表达之间的关系；通过细... 展开目的：检测hTERT mRNA及其蛋白在恶性黑素瘤及色素痣石蜡包埋组织中的表达，分析hTERT mRNA表达与恶性黑素瘤临床病理特征及其蛋白之间的关系；预测并筛选恶性黑素瘤中调控hTERT基因的相关miRNAs ，分析候选miRNAs与hTERT mRNA表达之间的关系；通过细胞功能学实验探索过表达或抑制相关miRNAs表达后对hTERT mRNA及其蛋白表达的影响；采用双荧光素酶报告基因实验分析相关miRNAs与hTERT基因的靶向调控机制。方法：采用qPCR及免疫组化检测hTERT mRNA及其蛋白在恶性黑素瘤及色素痣石蜡包埋组织中的表达；通过TargetScan在线软件预测hTERT基因调控相关的miRNAs，按照筛选标准筛选出候选miRNAs；采用定制的miRNA PCR Array检测候选miRNAs在恶性黑素瘤和色素痣石蜡包埋组织中的表达情况，筛选出相关差异表达的miRNAs；合成相关差异miRNAs的类似物和抑制物，转染到人恶性黑素瘤A 375细胞中，通过MTT法、流式细胞术、划痕实验和Transwells方法检测转染前后人恶性黑素瘤A375细胞的增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力等生物学行为的变化，同时采用qPCR及western-blot技术检测转染前后hTERT mRNA及其蛋白的变化水平；采用双荧光素酶报告基因实验探索相关差异miRNAs靶向调控hTERT基因的机制。结果：恶性黑素瘤组织中hTERT mRNA及其蛋白的表达均高于色素痣，发生远处转移者hTERT mRNA表达明显高于未发生者，且hTERT mRNA的表达与hTERT蛋白的表达呈正相关关系。经预测和筛选，共筛选出14个候选miRNAs，经定制的miRNA PCR Array检测发现5个差异表达的miRNAs：miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p表达明显下调，而miR-212-5p和miR-424-5p表达明显上调；且miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p的表达与hTERT mRNA及其蛋白的表达呈负相关。细胞功能学实验结果表明：过表达miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p均能够显著抑制人恶性黑素瘤A375细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并阻滞细胞周期、促进细胞凋亡；而抑制miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p的表达后均能够逆转过表达的效应。同时，过表达miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p后hTERT mRNA及其蛋白表达均明显减少。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p通过与hTERT基因3’UTR区直接结合参与调控恶性黑素瘤的发生和发展。结论：在人恶性黑素瘤中，miR-497-5p、miR-195-5p和miR-455-3p通过直接靶向作用于hTERT 3’UTR区发挥抑癌基因样作用，有望成为恶性黑素瘤靶向治疗的新选择。收起

关键词 : 恶性黑素瘤 hTERT基因 miRNAs 靶向治疗

7. Slug通过表观调控IGFBP3促进恶性黑素瘤侵袭转移的作用及机制研究

[学位论文] 吴楠吉林大学 2023年博士导师: 丛宪玲共111页

摘要 : 研究背景：恶性黑素瘤简称恶黑，起源于神经外胚层黑素细胞，可广泛的迁移至全身，包括皮肤、粘膜、葡萄膜、内耳和直肠等，是最具侵袭性和最为致命的恶性肿瘤之一，是皮肤癌相关死亡率的主要原因。恶黑早期诊断后通过手术切除可以取得较好的治... 展开研究背景：恶性黑素瘤简称恶黑，起源于神经外胚层黑素细胞，可广泛的迁移至全身，包括皮肤、粘膜、葡萄膜、内耳和直肠等，是最具侵袭性和最为致命的恶性肿瘤之一，是皮肤癌相关死亡率的主要原因。恶黑早期诊断后通过手术切除可以取得较好的治疗效果及预后，但晚期发生转移的患者预后极差。近年来免疫疗法以及分子靶向疗法的出现显著改善了预后，但其在恶黑患者应用中广泛存在耐药和严重免疫相关的不良反应等不足，因此进一步阐明恶黑转移的分子机制对寻找新的治疗靶点提高患者临床预后具有重要意义。上皮间质转化（EMT）是一个重要的细胞过程，过程中细胞失去上皮特征的极性、紧密连接以及相关的黏附能力，经过一系列复杂的生物学过程转变为具有间充质表型的细胞，最终获得侵袭转移的能力。三种主要的转录因子SNAIL家族、ZEB家族和TWIST家族在EMT过程的早期被激活，与EMT密切相关。其中SNAIL家族包括Snail1和Slug，是一种锌指转录抑制因子，在胚胎发生和肿瘤进展过程中调控EMT进程，可通过表观遗传方式抑制靶基因的表达，与肿瘤复发、转移和耐药机制密切相关，但Slug在恶黑中的作用及具体机制尚不明确。目的：研究Slug在恶黑侵袭转移过程中的作用及分子机制，进一步阐明恶黑发生发展的具体机制，为寻找恶黑更为有效的治疗靶点提供理论及实验基础。方法与结果：首先通过TCGA数据库分析发现EMT转录因子中，Slug在恶黑中的高表达与患者预后不良显著正相关，并且与临床分期显著相关。接着，通过qPCR方法在恶黑组织中检测了Slug在mRNA水平的表达情况，发现Slug在恶黑组织中显著高表达；同时，利用TCGA中的恶黑数据分析了Slug的表达与临床病理特征的关系，发现Slug的高表达与转移和TNM分期显著相关。接下来在多种恶黑细胞系中检测了Slug的表达水平，并在Slug表达较低的A375细胞系中构建了Slug稳定过表达的细胞系，在Slug表达较高的Mewo细胞系中构建了稳定敲低Slug的细胞系。通过CCK8实验、划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测了Slug对恶黑细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，发现Slug可以促进恶黑细胞EMT现象的发生，增强恶黑细胞体内和体外的迁移和侵袭能力。为了研究Slug促进恶黑细胞迁移和侵袭的分子机制，对Slug过表达的A375细胞系进行转录组测序以及生物信息学分析，并通过筛选及qPCR验证，发现IGFBP3在Slug过表达的细胞中表达降低，在Slug敲低的细胞中表达显著升高，推测其可能是Slug促进恶黑发展的关键基因。为了验证我们的猜想，通过回复实验，在Slug过表达的细胞系中转染IGFBP3的质粒进行过表达，在Slug敲低的细胞系中转染了IGFBP3的siRNA进行干涉，结果发现IGFBP3过表达后显著抑制了Slug对恶黑迁移和侵袭的促进作用，IGFBP3干涉后减弱了Slug敲低对恶黑迁移和侵袭的抑制作用。随后我们检测了PI3K/Akt/GSK3β通路中的关键蛋白表达，发现Slug-IGFBP3可通过PI3K/Akt/GSK3β通路促进恶黑的侵袭及转移。为了进一步探究Slug抑制IGFBP3表达的分子机制，我们通过质谱分析检测出HDAC3与Slug在恶黑细胞中可能存在相互作用，然后利用双荧光素酶报告基因分析、免疫共沉淀实验和染色质免疫共沉淀实验，结果发现Slug与HDAC3在恶黑中确实存在相互作用，通过去乙酰化和去乳酸化抑制IGFBP3启动子的转录活性，并且在HDAC3过表达后显著促进了Slug对恶黑细胞体外的迁移和侵袭作用，加入HDAC3抑制剂后显著抑制了Slug对恶黑细胞体外的迁移和侵袭作用，表明Slug通过招募HDAC3，共同募集在IGFBP3启动子区域，通过对其组蛋白去乙酰化和去乳酸化修饰，从而抑制了IGFBP3的转录和表达，最终促进恶黑的迁移和侵袭。结论： Slug在恶黑中高表达并且与恶黑患者预后不良显著相关。Slug可促进恶黑细胞体内外的迁移和侵袭，Slug通过抑制IGFBP3促进恶黑迁移和侵袭。Slug抑制IGFBP3通过促进PI3K/Akt/GSK3β信号通路促进恶黑的迁移和侵袭。Slug协同HDAC3降低IGFBP3的启动子区域H3K4乙酰化修饰和H4K5乳酸化修饰，抑制IGFBP3转录，进而促进恶黑的侵袭转移。收起

关键词 : 恶性黑素瘤 IGFBP3 HDAC3 Slug 侵袭转移

8. 单味中药脱色及复方含药血清对体外培养人A375黑素瘤细胞黑素代谢影响的研究

[学位论文] 刘利利南方医科大学 2012年硕士导师: 杨柳共76页

摘要 : 研究背景与目的：皮肤色素代谢障碍与多种体内因素和环境因素密切相关，色素障碍性疾病（如白癜风、黄褐斑）易诊而难治。随着分子生物学技术的广泛应用，有关色素代谢的研究迅猛开展。国内外学者积极探索色素代谢的机制及影响因素，阐述中药调... 展开研究背景与目的：皮肤色素代谢障碍与多种体内因素和环境因素密切相关，色素障碍性疾病（如白癜风、黄褐斑）易诊而难治。随着分子生物学技术的广泛应用，有关色素代谢的研究迅猛开展。国内外学者积极探索色素代谢的机制及影响因素，阐述中药调节色素代谢的作用机制，为治疗色素代谢性疾病寻找安全、有效的中药成分或方剂，对有关中药与色素的代谢方面进行了广泛的研究，但目前对其作用机理与规律仍未能得到深入的科学阐述，因此临床上缺乏较为理想治疗手段及方法。目前许多中药对酪氨酸酶活性、黑素细胞代谢的影响已经有了初步的揭示，研究的方法技术亦日益成熟。但是，大多数研究都局限于观察单味中药或复方中药的研究上，鲜有从中药色象理论的角度设计较为系统的多层次的研究，有关色象中药对黑素代谢影响与干预机理的研究尚为缺乏。吾师杨柳教授通过长期的临床探索与理论研究，在取象比类思维启示下创立了治疗色素性皮肤病的中药色象理论，形成了具有鲜明特色的理论和治疗方法。认为中药颜色与色素性皮肤病的疗效有一定的相关性，并首次将这种表明药材颜色与疗效相关的现象称之为“中药色象”，将这种治疗色素病色效相关的中药，称之为“色象中药”。初步研究中药药材颜色与色素性皮肤病的疗效之间的关系，并取得了一定的成果。我们的初步研究结果和以往学者的研究表明对药材本身的颜色与药效存在一定的关系，因此对中药色象理论的进一步研究，尤其是应用现代科学研究方法技术，对色象中药调节与干预色素代谢机理的现代分子学研究是非常有必要的。另外，白癜风作为色素脱失性疾病的典型病种，临床上易诊而难治。中医药治疗白癜风具有鲜明的特色，强调证候分型与辨证论治。但目前白癜风的证候分型及方药种类繁多，缺乏统一性和标准化。此外，在临床实践中许多白癜风患者出现“无症可辨”或“少症如何辨”的情况，基本除了皮肤出现白斑以外，没有其他特殊的伴随症状。对此，吾师提出了以“祛风、活血、补肾”为基本治则，并结合分期论治的治疗方案。基于此，本研究通过查阅大量的文献资料及临床资料，并结合临床实践经验，在以往研究的基础上，筛选出中医传统治验及现代研究表明治疗色素病有效的使用频率高的黑白两类中药共10味，以目前研究技术较为成熟的酪氨酸酶、细胞增殖及黑素合成作为观察指标，研究单味中药经活性炭脱色后对体外培养的人A375黑素瘤细胞黑素代谢的影响，以及采用中药血清学的方法研究4种具有不同功效的复方含药血清对黑素代谢的影响，进一步探讨色象中药与色素代谢的相关性，为色象理论及临床辨证用药提供科学依据，为以后白癜风的辨证治疗提供实验依据，同时为中医药治疗色素病的研究提供新的思路，以有效地指导临床。方法与内容： 1、通过查阅大量的文献资料及临床资料，并结合临床实践经验，在以往的研究基础上，筛选出中医传统治验及现代研究表明治疗色素病有效的使用频率高的中药，依据饮片的外在颜色分为黑（深色）、白（浅色）两组，每组各选5味药作为代表药，制备各单味中药水提液，取上述中药水提取液100ml，用紫光分光光度法进行测定吸光度值，采用正交试验法对每味中药的脱色工艺进行筛选，以最佳脱色条件进行脱色后取上清液过滤后备用，并用不含胎牛血清的培养基进行稀释，使药物终质量浓度为10μg/ml。 2、参照医学实验动物学及中药血清学的方法，制备四种不同功效配伍的复方含药血清，并用不含胎牛血清的培养基进行稀释，使含药血清的终浓度为5％、10％、20％、30％，并以此四种浓度进行研究。 3、应用细胞培养学技术，将人A375黑素瘤细胞株进行体外培养。采用多巴速率氧化法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中酪氨酸酶活性的影响，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞增殖的影响;采用NaOH裂解法测定黑白两组中药水提取液脱色前后、四种不同功效配伍的复方含药血清在不同浓度对细胞中黑素合成含量的影响。每种药物每个浓度设3个复孔，重复3次，并设对照组:单纯培养基组、中药对照组（培养基+中药）和空白对照组（培养基+细胞）。 3、应用SPSS13.0统计软件，分别采用单因素方差分析的Dunnett检验和析因设计资料的方差分析对单味中药和复方含药血清各组实验数据进行统计学处理与分析，数据均以（x）±s表示，以P≤0.05时表示差异有统计学意义。结果： 1、单味中药调节黑素代谢测定结果: ①未经活性炭脱色的中药中，制首乌、补骨脂、丹参、鸡血藤、墨旱莲、桃仁对TYR活性具有激活作用（P≤0.05或P≤0.01）;茯苓、白芷、白芨对TYR活性具有抑制作用（P≤0.05或P≤0.01）。而经活性炭脱色后，制首乌、墨旱莲对TYR活性无激活作用(P＞0.05)，丹参、鸡血藤、补骨脂对TYR活性的激活作用明显降低，与未脱色组比较，差异具有显著性（P≤0.05或P≤0.01）。桃仁、茯苓、白芷、白芨、白术脱色前后比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。 ②与空白对照组比较，未经活性炭脱色的中药中，制首乌、补骨脂、丹参、鸡血藤、桃仁对黑素细胞增殖具有促进作用(P≤0.05或P≤0.01);白芷、白芨、白术对黑素细胞增殖具有抑制作用(P≤0.01)。而经活性炭脱色后，丹参、鸡血藤对黑素细胞增殖无促进作用（P＞0.05），白术、白芨、补骨脂对黑素细胞抑制或促进作用明显降低，与未脱色组比较，差异具有显著性(P≤0.05)，茯苓脱色后对黑素细胞增殖具有促进作用，与未脱色组比较，差异具有显著性(P≤0.01)，桃仁、白芷、墨旱莲、白术脱色前后比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。 ③未经活性炭脱色的中药中，补骨脂、丹参、鸡血藤、桃仁对黑素细胞合成具有促进作用(P≤0.01);白芨、白术对黑素细胞合成具有抑制作用(P≤0.05)。而经活性炭脱色后，桃仁、鸡血藤对黑素细胞合成无促进作用(P＞0.05)，丹参、补骨脂对黑素细胞合成作用明显降低，与未脱色组比较，差异具有显著性（P≤0.05或P≤0.01），墨旱莲、茯苓脱色后对黑素细胞合成具有促进作用，与未脱色组比较，差异无统计学意义或具有显著性（P≤0.01），白芷脱色后对黑素细胞合成具有抑制作用，与未脱色组比较，差异具有显著性(P≤0.01)，制首乌、白芨、白术脱色前后比较，差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2、复方含药血清对黑素瘤细胞黑素代谢测定结果: ①相应浓度各方之间比较，含药血清浓度为5％时，与空白血清对照组比较，Ⅰ方、Ⅱ方、Ⅲ方对酪氨酸酶活性激活作用不显著，仅Ⅵ方含药血清对酪氨酸酶活性有显著激活作用(P=0.014＜0.05)，Ⅵ方对酪氨酸酶的激活作用显著高于Ⅰ方、Ⅱ方（P=0.01和P=0.004≤0.01），与Ⅲ方作用无显著差异(P=0.233＞0.05);含药血清浓度为10％时，各组之间比较差异无统计学意义(P=0.124＞0.05)。含药血清浓度为高浓度(20％-30％)时，与相应浓度空白血清对照组比较，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方对A375细胞酪氨酸酶活性均有激活作用，以Ⅵ方作用最显著(P＜0.001)，且与相应浓度的其它三方相比，差异有统计学意义（P≤0.001）。相应复方各浓度间比较:Ⅰ方各浓度间比较，随着浓度的增加，中药对酪氨酸酶的激活作用增强，20％与30％含药血清浓度对酪氨酸酶活性的影响无显著差异(P=0.203＞0.05)，与5％和10％含药血清浓度激活作用比较，有显著差异(P＜0.01)。Ⅱ方各浓度间比较，5％、20％、30％含药血清浓度对酪氨酸酶的激活作用与10％含药血清浓度相比，均有显著差异（P≤0.05或P≤0.01）,三种浓度间无显著差异(P=0.484＞0.05)。Ⅲ、Ⅵ方各浓度间比较差异均有显著意义（P≤0.01），中药对酪氨酸酶的激活作用随着含药血清浓度的增加而增强。 ②相应浓度各复方之间比较，含药血清浓度为低浓度5％～10％时，与空白血清对照组比较，各方对黑素增殖作用不显著，差异无统计学意义(P＞0.05)。含药血清浓度为20％时，与空白血清对照组比较，复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅵ方对黑素增殖均有明显促进作用，以Ⅵ方作用最显著(P＜0.001)，且与同血清浓度的其它三方相比，差异均有显著统计学意义(P≤0.001);含药血清浓度为30％时，与空白血清对照组比较，Ⅰ、Ⅲ、Ⅵ方对A375黑素瘤细胞黑素增殖有显著促进作用（P≤0.05或P≤0.01），各方之间比较，Ⅰ方、Ⅲ方与Ⅵ方比较，差异无统计学意义(P=0.419＞0.05)，Ⅱ方与Ⅵ方相比，差异有统计学意义(P=0.001＜0.01)。相应复方各浓度间比较:Ⅰ方各浓度间比较，随着浓度的增加，中药对黑素增殖的促进作用增强，20％与30％含药血清浓度对黑素增殖的促进作用无显著差异(P=0.831＞0.05)，与5％和10％含药血清浓度促增殖作用比较，均有显著差异(P≤0.01)。Ⅱ方各浓度间比较，10％、20％、30％含药血清浓度对黑素增殖的促进作用均高于5％含药血清浓度(P≤0.01)，其中20％含药血清浓度促进作用最强，与其它浓度比较差异有统计学意义（P≤0.01）。Ⅲ方、Ⅵ方各浓度间比较，均以20％含药血清浓度促黑素增殖作用最强，与其它含药血清浓度比较，差异有显著统计学意义(P＜0.01)。 ③中药各复方之间促进黑素合成作用比较差异有显著统计学意义(P＜0.001)，中药含药血清均能在一定程度上促进黑素合成，各复方对黑素合成促进作用高于空白血清对照组。复方Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ方之间比较，三者对黑素合成促进作用无显著差异(P=0.480＞0.05)，Ⅵ方对黑素合成促进作用显著高于其它组。复方中药不同含药血清浓度对黑素合成促进作用比较差异有显著差异(P＜0.001)，随着含药血清浓度的增加，各方对黑素合成促进作用增强，10％含药血清浓度对黑素合成的促进作用显著高于5％含药血清浓度，20％与30％含药血清浓度对黑素合成的促进作用显著高于5％、10％含药血清浓度，此两种浓度间比较无显著差异(P=0.915＞0.05)。结论： 1、经活性炭脱色后，黑色（深色）、白色（浅色）中药大部分失去或降低了对黑素代谢的促进或抑制作用，其中黑色药物更显著。说明药材颜色与色素代谢调节存在一定的相关性。 2、具有祛风、活血和补肾三重作用的Ⅵ方在促进黑素代谢的作用上优于祛风除湿Ⅰ方、养血活血Ⅱ方和滋补肝肾Ⅲ方，含药血清浓度为高浓度时作用最显著。表明白癜风治疗以祛风、活血、补肾为基本治则效果最好，这为以后临床中白癜风以“祛风、活血、补肾”为基本治则，并结合分期论治的治疗方案提供了实验根据，对白癜风辨证论治及病因病机理论的发展都具有重要的指导意义。收起

关键词 : 中药脱色含药血清黑素代谢黑素瘤

9. Pin1和Cyclin D1在皮肤黑素瘤中的表达

[学位论文] 王淑梅福建医科大学 2018年硕士导师: 程波共34页

摘要 : 目的： 1.了解Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤肿瘤组织以及癌旁正常组织的表达情况。 2.研究Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤中的表达与临床间联系。方法： 1.通过收集2015年1月至2017年12月在福建省皮皮肤病性病防治院诊断的原发性皮肤... 展开目的： 1.了解Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤肿瘤组织以及癌旁正常组织的表达情况。 2.研究Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤中的表达与临床间联系。方法： 1.通过收集2015年1月至2017年12月在福建省皮皮肤病性病防治院诊断的原发性皮肤黑素瘤，为了保证组化结果的准确性，设置了纳入标准以及排除标准，并且临床资料齐全的石蜡组织标本共 18 例。选择免疫组织化学染色方法了解Pin1与CyclinD1在肿瘤组织以及癌旁正常组织的表达情况。 2.采用统计学χ2检验方法进行检验，分析Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤肿瘤组织以及癌旁正常组织的表达情况，以及分析Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤的表达与临床间的联系。 3.采用统计学spearman等级相关分析两种标记在皮肤黑素瘤中表达的相关性。结果： 1.Pin1表达主要位于胞核及胞质中，也可见到胞膜呈棕色分布。在皮肤黑素瘤中Pin1表达阳性主要表现于肿瘤组织的胞核以及胞质，其中表达呈阳性的有14例，阳性率约 77.8%；癌旁正常组织 Pin1 阳性表达为 4 例，阳性率约 22.2%，通过χ2检验方法分析，发现肿瘤组织阳性率明显比癌旁正常组织高，差异有统计学意义（P＜0.05）。采用χ2检验方法检测Pin1与临床特征的联系，发现Pin1蛋白表达情况与患者年龄、性别、肿瘤直径大小及肿瘤位置无明显相关（P＞0.05），但与病理类型相关（P＜0.05）。 2.CyclinD1 表达主要位于胞核，也可见胞质散在棕色颗粒。在皮肤黑素瘤中CyclinD1表达呈阳性的有10例，阳性率约55.6%；癌旁正常组织极少量有表达，癌旁正常组织CyclinD1阳性表达为2例，阳性率为11.1%，通过χ2检验方法分析，发现肿瘤组织阳性率明显比癌旁正常组织高，差异有统计学意义（P＜0.05）。采用χ2检验方法检测CyclinD1表达与临床特征的联系，发现CyclinD1蛋白表达情况与患者年龄、性别、病理类型及肿瘤位置均无明显相关（P＞0.05），但与肿瘤直径大小相关（P＜0.05）。 3.Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤表达有相关性（P＜0.05）。结论： Pin1与CyclinD1在皮肤黑素瘤肿瘤组织的阳性表达明显高于癌旁正常组织，由于Pin1与CyclinD1可通过调控细胞周期，影响细胞增殖、死亡及转化，因此，我们可以发现 Pin1 与 CyclinD1 的异常表达可能参与了皮肤黑素瘤的发生与发展，或许可能成为皮肤黑素瘤治疗的靶点。收起

关键词 : 皮肤黑素瘤 CyclinD1 Pin1 细胞周期

10. 中国蜂胶及其黄酮类单体抗黑素瘤作用及其机制

[学位论文] 郑宇斐浙江大学 2020年博士导师: 胡福良共131页

摘要 : 黑素瘤是一种发展极为迅速的恶性皮肤病，具有发展迅速、恶性程度高、预后差、致死率高等特点。早期黑素瘤患者的5年存活率高达92％，但是黑素瘤一旦开始转移，患者的5年存活率迅速下降至15％。目前虽然关于黑素瘤研究已经有了一定的进展，然而针对黑... 展开黑素瘤是一种发展极为迅速的恶性皮肤病，具有发展迅速、恶性程度高、预后差、致死率高等特点。早期黑素瘤患者的5年存活率高达92％，但是黑素瘤一旦开始转移，患者的5年存活率迅速下降至15％。目前虽然关于黑素瘤研究已经有了一定的进展，然而针对黑素瘤的主要治疗方法效果并不显著，并且受到严重的副作用和黑素瘤耐药性的困扰。因此，对黑素瘤相关治疗药物和手段的研究仍是目前癌症研究的一个重点和热点。蜂胶是蜜蜂采集植物芽孢及伤口胶质物混合自身上颚腺分泌物而成的一种蜂产品，具有多种生物学活性，包括抗菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用。在抗肿瘤方面，有文献指出中国蜂胶可以有效地诱导包括乳腺癌、结肠癌在内的多种肿瘤发生细胞凋亡和周期阻滞，也是近几年蜂胶药理学研究的热点之一。基于蜂胶的前期抗肿瘤研究，本研究利用细胞模型和小鼠模型，系统性地探究了中国蜂胶及其黄酮类单体（松属素和柯因）对黑素瘤增殖、转移、自噬等方面的影响及其相关机制，以期揭示中国蜂胶的抗黑素瘤作用，为蜂胶的应用提供理论基础，也为黑素瘤的治疗提供新的思路。主要研究结果如下: 1中国蜂胶对黑素瘤的发展影响研究我们首次证明了中国蜂胶对黑素瘤细胞系A375的促凋亡作用和抑制转移作用并揭示其分子机制。在经中国蜂胶处理后，A375细胞发生内源性凋亡和细胞周期阻滞。在此基础上，我们发现中国蜂胶在黑素瘤细胞中也能发挥其出色的抗炎作用，caspase-1和caspase-4表达水平降低，同时伴随着IL-1α、IL-1β和IL-18mRNA水平的下降，进一步证明了中国蜂胶对黑素瘤炎性微环境的保持有抑制作用。我们还发现中国蜂胶可以在A375细胞中激活自噬，而抑制自噬会减弱中国蜂胶对黑素瘤的促凋亡作用，这也说明了自噬的发生增强了中国蜂胶对黑素瘤的细胞毒作用。此外，我们的实验结果证明中国蜂胶能减弱黑素瘤在体外的迁移能力。 2中国蜂胶抗黑素瘤单体活性成分筛选利用高效液相色谱，我们确定了本实验中使用的中国蜂胶的主要功能性成分，包括咖啡酸、p-香豆酸、阿魏酸、异阿魏酸、肉桂酸、山奈酚、杨梅桐、槲皮素、3，4-二甲氧基肉桂酸、芹菜素、短叶松素、柯因、松属素、高良姜素、咖啡酸苯乙酯和3-O-乙酰基短叶松素等。利用CCK-8实验，我们比较这其中高含量的功能性单体对黑素瘤细胞的细胞毒性，结果显示松属素、咖啡酸苯乙酯、柯因、短叶松素、芹菜素、咖啡酸二甲醚对黑素瘤的细胞活性都有一定的抑制作用。 3中国蜂胶活性成分松属素抗黑素瘤作用研究利用体内外模型进一步检测并探究了松属素对黑素瘤的抗肿瘤作用及其相关机制。在细胞实验中，我们发现松属素能诱导黑素瘤细胞（B16F10和A375）发生凋亡，并呈现浓度相关性。对凋亡调控通路的研究显示，松属素通过激活IRE1α/Xbp1通路引发内质网应激，从而活化下游蛋白caspase-12（鼠源细胞）/caspase-4（人源细胞）介导黑素瘤细胞凋亡。此外，我们的结果还显示松属素通过激活PI3K/Akt/mTOR通路抑制黑素瘤细胞中自噬的发生，增强了松属素对黑素瘤的促凋亡作用。在小鼠成瘤模型中，松属素显著抑制了黑素瘤在小鼠体内的生长，并且在肿瘤组织中我们检测到了高水平的凋亡信号。 4中国蜂胶活性成分柯因抑制黑素瘤转移效果研究我们证明了柯因可以有效抑制黑素瘤转移。通过细胞实验我们发现，在低浓度时，柯因也表现出了对黑素瘤细胞转移、侵袭和促血管生成能力很好的抑制作用。同时，柯因抑制了黑素瘤细胞的失巢凋亡抵抗，增加了其在转移过程中的凋亡率。进一步实验表明柯因通过下调FOXM1/β-catenin通路逆转了黑素瘤细胞上皮细胞间充质转化过程，而过表达FOXM1则会减弱柯因的抗黑素瘤转移作用。我们同时也在小鼠模型上验证了细胞实验的发现。利用肺转移模型，我们证明柯因处理能明显降低小鼠肺转移肿瘤的出现几率，同时在肺部肿瘤组织中，柯因治疗组FOXM1的表达量也更低。综上所述，本论文系统地研究了中国蜂胶的抗黑素瘤作用及其相关机制，有助于中国蜂胶的进一步开发与利用;通过研究中国蜂胶中主要功能活性单体的抗黑素瘤作用及其相关机制，揭示了中国蜂胶抗黑素瘤的物质成分基础，也为黑素瘤治疗药物开发提供了参考。收起

关键词 : 蜂胶黄酮类单体抗黑素瘤作用