摘要: 目的:非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)的进展阶段，与肝硬化及肝细胞癌等不良预后密切相关。外泌体中含有多种生物活性物质，可介导细胞间通讯，参与多种细胞功能... 展开 目的:非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)的进展阶段，与肝硬化及肝细胞癌等不良预后密切相关。外泌体中含有多种生物活性物质，可介导细胞间通讯，参与多种细胞功能调控。多项研究显示，外泌体在NASH的发生和进展中发挥重要作用。炎症是NAFL向NASH进展的标志性过程，巨噬细胞作为NASH肝脏炎症中的主要免疫细胞，其来源的外泌体在NASH中的相关作用及机制还未被探究。本研究旨在明确巨噬细胞源性外泌体在NASH发生发展中的作用，探究巨噬细胞源性外泌体分泌增多的相关机制，为寻找NASH的可能治疗手段提供理论基础。 方法: (1)明确巨噬细胞源性外泌体在NASH发生发展中的作用 第一，构建高脂高胆固醇饮食(highfatandhighcholesteroldiet，HFHC)诱导的NASH小鼠模型，通过对血清中巨噬细胞来源外泌体数量和体外肝脏巨噬细胞外泌体分泌的定量分析，明确NASH中巨噬细胞外泌体分泌数量的变化。第二，通过体内回输巨噬细胞源性外泌体，检测肝功能和病理评估等相关指标，评估巨噬细胞源性外泌体对HFHC诱导的肝脏损伤、脂肪变性、炎症和纤维化的影响。第三，利用荧光染料标记的巨噬细胞源性外泌体进行体内示踪，确定肝脏中内吞外泌体的主要靶细胞，并在体外探究巨噬细胞源性外泌体对靶细胞的作用。 (2)探究NASH中巨噬细胞源性外泌体分泌增多的机制 第一，利用HFHC诱导的NASH小鼠和经肝活检确诊的NASH患者，明确外泌体分泌相关蛋白RAB27A在NASH肝组织上和肝脏巨噬细胞上的表达水平。另外，利用RAB27A抑制剂作用于骨髓来源巨噬细胞，明确RAB27A在巨噬细胞外泌体分泌中的作用。第二，使用质谱分析法鉴定出与RAB27A蛋白具有相互作用的E3泛素连接酶，并进一步筛选在NASH中肝脏巨噬细胞上具有表达差异的候选分子。通过在巨噬细胞系上进行质粒过表达，明确可调控RAB27A蛋白表达水平和外泌体分泌的E3泛素连接酶。第三，通过免疫共沉淀法和免疫荧光染色确定E3泛素连接酶STUB1与RAB27A的蛋白相互作用，并利用泛素化实验、蛋白降解实验分析STUB1对RAB27A的作用机制。通过脂肪酸和脂多糖刺激骨髓来源巨噬细胞，明确STUB1及RAB27A在病理刺激下的蛋白水平及巨噬细胞外泌体分泌数量的变化。再通过在骨髓来源巨噬细胞上敲低Stub1,验证STUB1与RAB27A在巨噬细胞外泌体分泌中的作用。 (3)探索靶向巨噬细胞源性外泌体分泌增多机制的治疗手段 第一，通过预测STUB1与RAB27A的蛋白相互作用结构域中的α-螺旋肽序列，设计具有阻断作用的多肽。第二，在HEK293T细胞中，利用免疫共沉淀法筛选出可阻断STUB1与RAB27A相互结合的多肽，并在体外骨髓来源巨噬细胞模型中验证其对巨噬细胞外泌体分泌的阻断作用。第三，使用多肽治疗HFHC诱导的NASH小鼠，检测肝功能和病理评估等相关指标，评估多肽对HFHC诱导的肝脏损伤、脂肪变性、炎症和纤维化的影响。 结果: (1)巨噬细胞源性外泌体通过加重肝细胞内脂质积累和炎症反应促进NASH发生发展 在HFHC诱导的NASH小鼠中，血清中总外泌体和巨噬细胞来源外泌体数量显著增加，且肝脏巨噬细胞外泌体分泌增多。通过体内回输实验发现，巨噬细胞源性外泌体可加重HFHC诱导的葡萄糖耐量以及胰岛素敏感性受损、肝脏损伤、肝脏脂肪变性、炎症及纤维化程度。体内回输荧光标记的外泌体显示，巨噬细胞源性外泌体主要被肝细胞所内吞。将巨噬细胞源性外泌体作用于体外原代肝细胞后，能促进肝细胞内脂质积累及炎症反应。 (2)STUB1-RAB27A轴介导NASH中巨噬细胞外泌体的分泌增加 RAB27A在NASH小鼠及NASH患者的肝组织中表达上调，且在NASH小鼠肝脏巨噬细胞上高表达，同时体外抑制RAB27A的蛋白功能可以减少骨髓来源巨噬细胞的外泌体分泌。通过质谱鉴定和实验验证发现，STUB1和TRIM21是能与RAB27A结合且在NASH小鼠肝脏巨噬细胞上具有表达差异的E3泛素连接酶。在巨噬细胞系上发现STUB1过表达可引起RAB27A蛋白水平增加及巨噬细胞外泌体分泌增多。机制研究发现，STUB1可通过与RAB27A相互结合，对RAB27A进行泛素化修饰，上调RAB27A的蛋白稳定性，从而使RAB27A蛋白水平增加。在体外，骨髓来源巨噬细胞的STUB1及RAB27A蛋白和外泌体分泌水平随病理刺激时间而上升，而抑制STUB1的基因表达可阻断RAB27A蛋白和外泌体分泌的增加。 (3)多肽PepRab2通过阻断STUB1-RAB27A改善NASH 根据STUB1-RAB27A的蛋白-蛋白相互作用结构域，设计并合成了3条多肽，其中多肽PepRab2可阻断STUB1-RAB27A的相互作用，并可减少骨髓来源巨噬细胞在病理刺激下的外泌体分泌。使用多肽PepRab2治疗HFHC饮食诱导的NASH小鼠，可减轻HFHC诱导的葡萄糖耐量以及胰岛素敏感性受损、肝脏损伤、肝脏脂肪变性、炎症及纤维化程度，说明多肽PepRab2在NASH中具有良好的疗效。 结论:NASH中巨噬细胞外泌体分泌增多，可加重肝细胞脂质积累及炎症反应，促进NASH的发生发展。巨噬细胞上高表达的STUB1可通过对RAB27A进行泛素化修饰，增加RAB27A的蛋白稳定性，上调RAB27A蛋白水平，增加RAB27A介导的外泌体分泌。使用多肽PepRab2阻断STUB1-RAB27A具有良好的NASH治疗效果，是NASH潜在治疗手段之一。 收起