摘要: 实验目的： 非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征，非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一种... 展开 实验目的： 非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一种无过量饮酒史，以肝细胞脂肪变性和脂质贮积为特征的临床病理综合征，非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis,NASH)是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的一种高级形式，可发展为肝硬化和肝细胞癌(HCC)。据估计，全球超过25％ 的人口患有NAFLD,并有发展为NASH的风险，给社会造成了巨大的医疗和经济负担[1]。与单纯的脂肪肝相比，NASH的特点是广泛的炎症和明显的肝细胞死亡，从而进一步促进肝纤维化的发展。NAFLD的基本治疗原则是改变生活方式、坚持运动、减轻体重等，目前尚没有明确的特效药物治疗，NASH发展过程中的分子机制仍有待充分了解。 EF手性域家族成员D2(EFHD2),也被称为swiprosin-1,是钙结合EF-hand钙离子结合蛋白超家族的一员。EFHD2最早在淋巴细胞中被发现12]，在T淋巴细胞中，EFHD2与程序性细胞死亡1(PD-1)的相互作用是T细胞介导的细胞毒性和抗肿瘤免疫反应所必需的[3]。除了淋巴细胞，越来越多的研究[48],包括我们的研究，已经发现EFHD2在巨噬细胞/单核细胞中高度表达，参与巨噬细胞的迁移和炎症因子的分泌。我们前期研究发现，EFHD2在NASH患者中表达增高，提示EFHD2可能参与了 NASH的发展进程。在本文中，我们探究了 EFHD2在NASH发展过程中的作用及相关分子机制，期待为后期NASH治疗药物的靶点提供新思路。 实验方法及结果： 1.NASH患者和NASH模型小鼠肝脏组织中EFHD2表达升高 本实验在上海市第十人民医院收集了 10个不患有NASH但有其他疾病的患者和10个患有NASH的患者肝脏样本，该研究得到了上海市第十人民医院伦理委员会的批准(批准文号：SHSY-IEC-4.1/19-126/01)。动物实验使用C57BL/6J小鼠，利用胆碱缺乏、左旋氨基酸高脂饲料(CDAHFD)和高脂肪高胆固醇饲料(HFHC)两种饮食诱导小鼠NASH模型，饲喂16周后收集小鼠肝脏样本。利用蛋白免疫印迹、RT-qPCR以及免疫组化等手段检测肝脏组织上EFHD2的表达，发现NASH患者和NASH模型小鼠肝脏组织中EFHD2的蛋白水平和mRNA水平均升高，该结果提示：EFHD2可能参与了 NASH发展进程。 2.EFHD2基因敲除可以缓解CDAHFD和HFHC诱导的小鼠NASH进程 利用重组技术从含有EFHD2基因(C57BL/6J自交系)的细菌人工染色体(BAC)中生成一个基因靶向结构。用该结构转染E14ES细胞，将靶向ES细胞注入C57BL/6J囊胚中，在种系中携带2-4号外显子缺失的靶向等位基因的小鼠被培育成EFHD2KO小鼠，同窝出生的野生型(WT)小鼠作为对照。本实验分别使用了胆碱缺乏、左旋氨基酸高脂饲料(CDAHFD)饮食和高脂肪高胆固醇饲料(HFHC)饮食去构建小鼠NASH模型。两种饲料造模周期均为16周，造模结束后收集血清及肝脏组织。 血清中ALT和AST活力检测结果显示，CDAHFD和HFHC饲喂后WT小鼠血清中ALT、AST活力显著上升，敲除EFHD2基因后ALT、AST活力下降。HE染色结果显示，CDAHFD和HFHC饲喂小鼠肝脏损伤明显，肝细胞排列紊乱并伴随出现大量脂滴泡，敲除EFHD2基因后可以缓解CDAHFD和HFHC饲喂导致的肝脏损伤。小鼠肝脏组织油红0染色、Masson染色和天狼星红染色结果显示CDAHFD和HFHC饲喂后WT小鼠出现了明显的肝脏脂肪变性和纤维化病变，敲除EFHD2基因后可以改善CDAHFD和HFHC饲喂导致的肝脏脂肪变性和纤维化。蛋白免疫印迹和RT-qPCR检测结果显示CDAHFD和HFHC饲喂后WT小鼠肝脏的炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)、细胞核因子-κB(NF-κBp65)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的蛋白表达水平均显著上升，相关趋化因子的mRNA表达水平显著上升，包括趋化因子(C-X-C基序)配体1(Cxcl1)、趋化因子(C-X-C基序)配体10(Cxcl10)和CC类趋化因子配体5(Ccl5),在EFHD2KO小鼠中相关炎症因子和趋化因子的表达均下降。以上结果提示EFHD2敲除后可以缓解小鼠NASH进程。 3.NASH小鼠中EFHD2主要表达在肝脏巨噬细胞 前期实验中人类和小鼠肝脏的EFHD2免疫组化图可以初步判断EFHD2表达在肝脏非实质细胞，所以我们想进一步判断EFHD2主要来源于肝脏哪种类型的细胞。在公开的人类图谱数据库(www.proteinatlas.org)中查阅单细胞RNA测序数据可以看出，EFHD2在正常的人类肝脏组织中主要表达在肝脏枯否细胞(Kupffer cells,KCs)和T细胞。在NASH小鼠肝脏中，EFHD2和F4/80(巨噬细胞的标志物)免疫荧光双染结果显示，大约50％-60％的EFHD2阳性细胞与F4/80共染。然而，EFHD2和αSMA(肝脏星状细胞的标志物)的免疫荧光双染或CD3(T细胞的标志物)的免疫荧光双染表明，EFHD2阳性细胞几乎没有与αSMA或CD3共染，该结果提示NASH小鼠中EFHD2主要表达在肝脏巨噬细胞。 4.髓系特异性敲除EFHD2延缓CDAHFD诱导的小鼠NASH进程 通过CRISPR-Cas9技术构建Efhd2flox/flox小鼠，Efhd2的2号外显子两侧插入了两个loxp位点，用于cre酶介导的切除，即为Efhd2flox/floxLysm-Cre小鼠，同窝出生的Efhd2flox/flox作为对照组。普通饲料和CDAHFD饲喂16周后，处死小鼠收集血清及肝脏组织。血清中血脂相关指标TC、TG和肝脏转氨酶ALT、AST检测结果显示，CDAHFD饲喂后Efhd2flox/flx小鼠中TC、TG、ALT、AST活力水平显著上升，在Efhd2flox/flox Lysm-Cre小鼠中该作用被抑制。HE染色结果显示：饲喂CDAHFD后，与Efhd2flox/flox小鼠相比，Efhd2flox/floxLysm-Cre小鼠肝脏损伤减轻，肝脏脂滴泡减少。小鼠肝脏组织冰冻切片油红O染色、Masson染色、天狼星红染色结果显示：饲喂CDAHFD后，与Efhd2flox/flox小鼠相比，Efhd2flox/flox Lysm-Cre小鼠的肝脏脂肪变性和纤维化程度显著减轻。蛋白免疫印迹结果显示，CDAHFD饲喂16周后，Efhd2flox/flox小鼠肝脏相关炎症因子TNF-α、IL-6、NF-κB p65、MCP-1的蛋白表达水平均显著上升，而在髓系特异性敲除EFHD2后，相关炎症因子的蛋白表达水平下降。此外，CDAHFD饲喂16周后，相关趋化因子的mRNA表达水平显著上升，包括Cxcll、Cxcl10和Ccl5,而在髓系特异性敲除EFHD2后，相关趋化因子的mRNA表达水平下降。接下来，我们使用多色流式细胞仪研究了髓系特异性敲除EFHD2对NASH条件下肝脏巨噬细胞/单核细胞群的组成和功能的影响。根据CD11b、F4/80、Ly6C、CD64、MerTk、CCR2、CD163和TIM4的不同表达，确定肝脏巨噬细胞/单核细胞亚群。有趣的是，我们发现在正常饮食或NASH条件下，Efhd2flox/flox小鼠和Efhd2flox/flox Lysm-Cre 小鼠在 NASH 肝脏中的 KCs(CD45+CD11bintF4/80hi) 比例是相当的。然而，在NASH条件下，浸润性巨噬细胞(IMs,CD45+CD11bhiF4/80int)的比例被诱导上升约7倍。值得注意的是，在NASH条件下，Efhd2flox/flox Lysm-Cre小鼠与Efhd2flox/flox小鼠相比，IMs的比例下降了约50％。在全部KCs中，Efhd2flox/flox小鼠肝脏中 TIM4hi-ResKCs(CD45+CD1 1bintF4/80hiTIM4hi)的比例从约 95％下降到约80％,这在Efhd2flox/flox Lysm-Cre小鼠中得到部分阻止。相反，在NASH条件下，Efhd2flox/flox 小鼠肝脏中 TIM4lo-MoKCs(CD45+CD11bintF4/80hiTIM4lo)的比例增加了约5倍，而这种变化在Efhd2flox/flox Lysm-Cre小鼠中被抑制了。此外，与Efhd2flox/flox小鼠相比， Efhd2flox/flox Lysm-Cre 中的M1样IMs(CD45+CD11bhiF4/80intCD64hiCD163lo)的比例明显更低。。 实验结论： 1.EFHD2是NASH的一个关键启动因子，在NASH患者和小鼠模型中显著诱发。 2.全身性敲除EFHD2可以缓解CDAHFD和HFHC诱导的小鼠NASH发展进程。 3.在小鼠NASH模型中，EFHD2主要在肝脏内的巨噬细胞中表达;4.髓系特异性敲除EFHD2后可以缓解小鼠NASH发展的进程。 收起